Fijadores 28356c

Universidad Nacional de Chimborazo FACULTA DE CIENCIAS DE LA SALUD CARRERA DE LABORATORIO CLÍNICO E HISTOPATOLÓGICO TÉCNICAS HISTOLOGICAS DOCENTE: IVÁN PEÑAFIEL MÉNDEZ TEMA : FIJADORES HISTOLÓGICOS GRUPO 6: JACKELINE MULLO ELIZABETH OVANDO YÁNEZ MARCO ROJAS

FIJADORES HISTOLOGICOS En anatomía patológica el primero objetivo consiste en observar la estructura histológica lo más parecido posible a como se encuentra en el organismo, por lo tanto el órgano debe ser fijado después de su extirpación con el fin de que se conserve lo más veraz posible sus estructuras celulares, Para de esta manera observar tanto el buen funcionamiento y estructuras que componen del órgano así como la patología de mismo. Pea ello se debe mantener toda su estructura química lo más inalterada posible, de tal forma que sus componentes celulares mantengan las mismas características que cuando dicho ser o tejido estaban vivos.

FIJADORES HISTOLOGICOS 

Pea ello se debe mantener toda su estructura química lo más inalterada posible, de tal forma que sus componentes celulares mantengan las mismas características que cuando dicho tejido estaban vivo.

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Los objetivos de la fijación son:

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Mantener las estructuras en el estado más parecido al que poseían en vivo.



Evitar la lisis celular y la proliferación bacteriana



Dar cierta solidez o dureza al tejido o material. La fijación detiene los procesos vitales pero en ciertas condiciones mantiene las actividades de algunos componentes moleculares, por ejemplo la actividad de algunas enzimas

Los objetivos de la fijación son  Mantener

las estructuras en el estado más parecido al que poseían en vivo.

 Evitar  Dar

la lisis celular y la proliferación bacteriana

cierta solidez o dureza al tejido o material. La fijación detiene los procesos vitales pero en ciertas condiciones mantiene las actividades de algunos componentes moleculares, por ejemplo la actividad de algunas enzimas

Características de un Fijador Ideal Las características que debe tener un buen fijador son las siguientes  Debe

tener la capacidad de bloquear la autolisis inmediatamente ( Destrucción celular )

 Debe

poseer efecto microbicida, impidiendo la acción bacteriana, la cual provoca la degradación del tejido

 No

debe provocar retracciones o distorsiones las cuales pueden alterar sus arquitectura

 Debe

cuidar la textura y composición tisular que favorezca la inclusión, el corte y la coloración del materia histológico

Tiempo de Acción 

Se denomina velocidad de penetración a la rapidez con la que un fijador se difunde en el interior de un tejido. Este tiempo varía con relación al tipo de fijador que se utiliza, al tamaño y la naturaleza de la muestra además de la temperatura de fijación.

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Por lo tanto el tiempo de fijación va a variar en rango muy amplios. En cualquier circunstancia, siempre deben respetarse los tiempos recomendados para cada tipo de fijador

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Los fijadores más utilizados son

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Alcohol

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Acetona

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Formalina

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Todos estos fijadores se caracterizan por tener una velocidad de penetración de 0,9 mm/h

Métodos de Fijación Existen diferentes formas de fijar los tejidos dependiendo del tipo de fijador

Se pueden Clasificar en dos tipos Físicos y Químicos

Fijadores Físicos Son aquellos que detiene la Autolisis y la putrefacción se basan en una congelación muy rápida del tejido o bien en la aplicación de calor elevado. Se utilizan cuando los fijadores químicos alteran la estructuras que se desean observar o cuando necesitamos una fijación muy rápida,

Fijadores Físicos Los fijadores por métodos físicos se utilizan principalmente para estudios morfológicos y funcionales en los que se quiera mantener intacta la estructura del tejido.

Congelación: Es el método el cual consistes en el enfriamiento por congelación para la fijación del tejido para realizar estudios morfológicos o funcionales de los mismos La clave para una correcta fijación por congelación del tejido es que su realización sea instantánea porque un enfriamiento lento provoca la formación de micro cristales titulares de hielo dificultando el diagnostico

Fijadores Físicos CONGELACION El procedimiento para fijar tejidos por congelación consiste en utilizar ISOPENTANO a menos de 50ºC como agente de congelación y realizar una fragmentación suficiente de la muestra que se vaya a congelar.

Normalmente se preparan bloques de no más de 3 cm. cuadrados de superficie y 3 mm de espesor de modo que el proceso de congelación instantánea no requiera más de 10 segundos. 

Al enfriar tanto no actúan bacterias ni enzimas y el tejido se endurece para cortar estos tejidos utilizamos el micrótomo de congelación

Fijadores Físicos Criodesecación • Consiste en someter al tejido a dos procesos • el primero es la congelación en Nitrógeno líquido fijación por • el segundo desecación por sublimación directa del agua congelada • tiene una ventaja muy importante y es que al eliminar totalmente el agua tisular, paraliza la autolisis y produce una conservación indefinida

Criosustitución: • es la sustitución lenta y progresiva del agua congelada de un tejido por un líquido fijador • Tras la congelación instantánea del tejido con nitrógeno liquido o isopentano a - 50ºC se coloca el tejido congelado en el medio de sustitución, El cual esta formado por una mezcla de alcohol etílico, acetona y propilén- glicol., enfriado a -40ºC, • El intercambio del agua de realizarse dentro de un congelador para procurarse que la temperatura se mantenga

Fijadores Químicos Son líquidos que actúan desnaturalizando e insolubilizando las proteínas tisulares, lo cual bloquea la autolisis por inactivación enzimática Además algunos de estos líquidos fijadores impiden el crecimiento bacteriano

Líquidos fijadores simple  FORMOL

o FORMALDEIDO:

El que mas se utiliza es el formol a 10 %, es el fijador por excelencia en anatomía patológica , ya que permite una buena conservación de todos los detalles histológicos del tejido, y realiza diversas étnicas especiales

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En estado puedo se trata de un gas toxico y muy irritante para la mucosa, que se disuelve con facilidad en agua. En este estado en concentraciones 35 y 40 % y estabilizado se denomina formalina pura o formol

Ventajas del usar Formol

1.Conserva la estructura tisular 2. Por se un buen desinfectante y no endurecer de manera excesiva los tejidos, es un medio optimo para conservar y almacenar biopsias y piezas quirúrgicas 3.Provoca escasa retracción Tisular 4.Posee velocidad de penetración inmediata 5.Es un excelente fijador para el tejido adiposo y para líquidos en general así como para el tejido nervosos 6. El proceso de fijación puede ser acelerado o retardado sin inconvenientes modificando la temperatura En temperatura ambiente se consigue una fijación completa a partir de las 36 h mientras que a 35 °C entre 12 y 24 horas y a 55°C en solo 3 H 7.Es compatible con la mayor parte de tinciones

Desventajas del usar Formol

Produce abundante vapores irritantes sobre la conjuntiva y mucosa nasal Por acción de la luz y del oxigeno se transforma de manera progresiva en acido fórmico. Lo que afecta a las estructuras celulares “cromatina” Por eso se debe guardar en frascos opacos

Alcohol Etílico 

Es un Liquido transparente, inflamable, ,uy volátil y de olor agradable. Como fijador se encuentra a concentraciones de 70, 90, y 95 %

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El tiempo de fijación correspondiente a una pieza de 5mm de espesor es dos a cuatro horas renovando unas 3 veces el líquido.

Ventajas y Desventajas 1.Preserva el glucógeno 2. Se emplea en las extensiones citológicas 3. Fija y deshidrata el tejido 4. Gran velocidad de Penetración 5. Es un agente bactericida y por lo tanto un buen conservante

1. Es un fuerte reductor, por consiguiente, incompatible con fijadores 2. Endurece y contrae de manera excesiva los tejidos 3. Disuelve las grasas

Acetona 

Líquido transparente, inflamable, muy volátil y de olor dulzón.

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Su uso como fijador está prácticamente limitado a los métodos hitoquímicos e inmunohistoquímicos porque conserva muy bien la estructura antigénica y la actividad enzimática, a veces también se utiliza en microscopia electrónica para la fijación del material que se va a incluir en resinas acrílicas.

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Se emplea generalmente sin diluir a 4ºC

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El tiempo de fijación nunca excederá de dos horas y en piezas delgadas son recomendables 20 minutos .

Ventajas y desventajas del uso de cetona Las desventajas que presenta son las siguientes: Tiene las ventajas siguientes: 1. Se utiliza en las técnicas enzimáticas. 2. Se emplea en la inmunohistoquímica

1. Provoca contracción tisular y, por tanto, graves artefactos que suelen hacer inútil su empleo en microscopia óptica convencional. 2. A temperatura superior de 40 °C, disuelve las grasas.

Ácido Acético: 

Líquido transparente y fuerte olor avinagrado. Conserva la cromatina. Retrae los tejidos. Es más un conservante que un fijador.

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Se utiliza diluido en concentraciones entre el 1 y 5 % formando parte de mezclas fijadores o de soluciones descalcificantes

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Ventajas que tiene es el fijador ideal para núcleo proteínas y acido nucleicos y otra es precipitar proteínas sin sustraer el agua de los tejidos porque no es giroscópico y produce cierto edema intersticial que compensa la excesiva refracción pausado por otros agentes fijadores.

 Desventajas: es mal fijador de citoplasma y membranas celular y destruye mitocondrias.

Ácido Pícrico: 

Actúa coagulando las proteínas a través de la formación de picratos que las confieren gran apetencia por colorantes ácidos.

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Se utiliza en solución saturada al 2%, es un excelente fijador estructural que conserva adecuadamente la composición proteica de los tejidos. Controlando adecuadamente el tiempo de fijación produce una óptima contracción de los tejidos que favorece su procesamiento histológico.

Desventajas del Ácido Pícrico: 

En estado puro el ácido pícrico es explosivo si se somete a color hay que mantenerlo alejado de fuentes de color,

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Si se prolonga el efecto de fijación que es de 4-18 horas dependiendo de tamaño pieza aparecen inconvenientes por una excesiva retracción tisular. Sobre todo si la pieza ha sido inadecuadamente lavado en agua y luego deshidratada.

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Tiñe los tejidos de color amarillo y si no se elimina completamente antes de la inclusión en parafina provoca un continuo deterioro de la estructura tisular que pueda hacer imposible su estudio histopatológico

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La eliminación se realiza mediante lavados sucesivos en alcohol etílico al 7080% lo que es incompatible en la inclusión en celoidina.

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https://www.youtube.com/watch?v=LRmum06psn8

Líquidos fijadores simples  Alcohol

Metílico: Se emplea con frecuencia

para fijar frotis desecados(sangre, médula ósea, ganglios, bazo, líquidos extraídos por punción, etc.).  Ácido

ósmico. en disolución a 1 o 2 %,

conserva muy bien las estructuras. Tiñe de negro las grasas y es poco penetrante.

Mezclas fijadoras 

La mayor parte de los procesos de fijación usan varias sustancias fijadoras, bien mezcladas en la solución acuosa inicial o utilizadas sucesivamente en el tiempo. Con ello se aprovechan las ventajas de cada una de ellas y se pueden contrarrestar sus desventajas.

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A continuación vamos a mencionar algunas combinaciones usadas frecuentemente porque tienen unas propiedades de fijación que las hace apropiadas para las observación de una gran variedad de tejidos y para el uso diversas de técnicas de tinción.

Mezclas fijadoras 

Glutaraldehido: líquido oleoso en comercios se encuentra en disolución al 25%. Mecanismo de actuación es el mismo que el formaldehído y como fijador se emplea en concentraciones entre el 1 y el 3%

Mezclas fijadoras

Glutaraldehido:  Ventajas • Es el primer fijador de elección para microscopía electrónica porque tienen una excepcional capacidad para preservar la morfología celular. • Se emplea para fijación de tejidos por perfusión en patología.

Desventajas • Tiene velocidad de penetración muy baja por lo que los fragmentos de tejido no pueden tener volumen superior a unos pocos milímetros cúbicos. • Posee gran capacidad de retracción y endurecimiento tisular que impide prolongar el tiempo de fijación por encima de las 3 horas.

Mezclas fijadoras 

Tetraóxido de Osmio: OsO4 : En el comercio se encuentra en forma de cristales amarillentos solubles en agua, muy volátiles y tóxicas. Actúa igual que el formol y se prepara como agente fijador al 1% en tampón fosfato.

Mezclas fijadoras Tetraóxido de Osmio: Ventajas • Es el mejor fijador estructural conocido, por eso se utiliza en microscopía electrónica específicamente como 2º fijador.

Desventajas • Muy caro y descompone en preseca de luz por lo que hay que conservarlo en recipientes opacos y oscuridad • Posee muy baja capacidad de penetración tisular por lo que las muestras deben tener muy poco volumen. • Es incompatible con formol y dificulta la coloración nuclear, esto obliga a lavar abundantemente los tejidos tras utilizarlo.

FIJADORES QUE CONTIENEN  Fijador de Bouin (1897): muy utilizado en histología embriológica y para órganos genitales. FORMOL Asimismo, se lo recomienda cuando se desea colorear con cualquier técnica tricrómica para la diferenciación de tejido muscular y conectivo. Las muestras se deben lavar con etanol a 70

Se prepara de la siguiente manera: SOLUCIÓN ACUOSA DE ÁC. PÍCRICO……

Para Preparar la solución se disuelve primero la sal de cobre en el agua destilada luego se añade el acido pícrico y tras filtrado el formol y el acido acético glacial

750.0 ml FORMALINA CONCENTRADA…250.0 ml ÁC. ACÉTICO GLACIAL…50.0 ml PH. FINAL…2.2 TIEMPO DE FIJACIÓN…2 A 24 HORAS

FIJADORES QUE CONTIENEN  FORMOL Fijador de Bouin-Hollander: es una variante del líquido de Bouin especialmente indicado para la fijación de los cilindros de biopsia de médula ósea la conservación, es de 48 horas sin que se produzca excesivo endurecimiento. Para preparar la solución se disuelve primero la sal de cobre en el agua destilada luego se añade el ácido pícrico y tras filtrarlos el formol y el ácido acético glacial. Esta solución se conserva indefinidamente a temperatura ambiente el tiempo de fijación oscila entre 48-72 horas

Se prepara de la siguiente manera: ACETATO NEUTRO DE COBRE……2.5 gr. ÁC. PÍCRICO……4.0 gr. FORMALINA CONCENTRADA……10.0 ml. ÁC. ACÉTICO GLACIAL…1.5 ml. AGUA DESTILADA…100.0 ml.

FIJADORES QUE CONTIENEN  FORMOL Fijador de Müller: Es la disolución acuosa de un fijador simple de dicromato potásico con la adición de sulfato sódico su importancia actual radica en que se emplea para fabricar los fijadores de Orth y de Zenker. Lo que llamamos solución madre. Está compuesta de:

Tiempo de fijación 4 y 8 horas. Tras la fijación es necesario lavar abundantemente en agua corriente durante unas horas

• DICROMATO POTASICO……2.5gr. • SULFATO SÓDICO……….1.0 gr. • AGUA DESTILADA ………100.0 ml.

FIJADORES QUE CONTIENEN FORMOL  Fijador de Orth: Se emplea exclusivamente en cietas tecnicas de fijación de tejido nervioso

El tiempo de fijación de tejido nervioso es de 48 horas y tras el proceso de fijación los tejidos han de ser lavados abundantemente en agua y almacenados en alcohol etílico al 70%

• Solución stock de Orth: idéntica a la composición del fijador de Müller. • Solución de trabajo: en el momento de su uso se mezclan: • SOLUCIÓN STOCK………90.0 ml. • FORMULINA CONCENTRADA……10.0 ml.

FIJADORES QUE CONTIENEN  Solución de B-5 y Zenker-Formol (Liquido de Nelly) : Ambas FORMOL mezclas son en esencia casi idénticas. La solución de Zenker-formol contiene dicromato potásico y sulfato sódico.

La denominación B5 corresponde en realidad a una modificación de la de Zenker.

• • • •

CLORURO MERCÚRICO……5gr. DICROMATO POTÁSICO…2.5 gr. SULFATO SÓDICO …………1 gr. AGUA DESTILADA C.S.P..100.0 ml.

• CLORURO MERCÚRICO...12.0 gr. ACETATO SÓDICO…. 2.5 gr. AGUA DESTILADA C.S.P….200 ml.

La mayor utilidad de estos fijadores es que mejoran considerablemente la tinción nuclear, para el diagnóstico morfológico en las patologías del sistema linfoide y hematopoyético Además estas soluciones B5 zenker formol son los fijadores de elección para el riñón, hígado, fibras de tejido conectivo y para fibrin

Eliminación del pigmento mercúrico 

Se realiza tratando las secciones histológicas antes de su coloración con soluciones yodadas y utilizamos:

Después de la desparafinación hay que tratar los cortes durante diez minutos con la solución yodada a continuación lavar bien en agua destilada después decolorar durante dos minutos en la solución en agua corriente durante 10 minutos antes de realizar la coloración

Solución de LUGOL: • YODURO POTÁSICO….2gr. • CRISTALES DE YODO ….1gr. • ALCOHOL ETÍLICO 70-80%....100 ml. Solución de tiosulfato sódico: • TIOSULFATO SÓDICO….5gr. • AGUA DESTILADA…100ml.

FIJADORES QUE NO CONTIENEN FORMOL Líquido de Zenker: se la puede emplear para la preservación de 

componentes ricos en sangre y para la realización de métodos tricrómicos y coloración de miofilamentos.

En el momento de usar de debe agregar 5 ml de ácido acético glacial por cada 95 ml de la solución stock

Cloruro de mercurio 12.5 gr Dicromato de potasio 6.3 gr Sulfato de sodio 2.5 gr Agua destilada 250 ml

FIJADORES QUE CONTIENEN FORMOL 

Líquido de Carnoy (1887): fórmula que penetra muy rápidamente y tiene aplicación en citología para la coloración de ácidos nucleicos. También preserva glucógeno. Tiende a destruir micobacterias.

Composición • Etanol absoluto 60 ml • Cloroformo 30 ml • Acido acético 10 ml

El tiempo de fijación puede ser acortado hasta 3 horas. Las muestras deben cambiarse directamente a alcohol etílico absoluto. El mayor endurecimiento se produce al prolongar demasiado la deshidratación en alcohol, para prevenirlo se puede sustituir el etanol por metanol en la composición de líquido fijador

GR AC I

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