Extrac Plas 596k

Extraction de l’ADN plasmidique par lyse alcaline

Définition d’un plasmide : c’est une molécule d'ADN circulaire bicaténaire extrachromosomique à réplication autonome. Les plasmides se trouvent dans le cytoplasme des bactéries ou des levures. Ils sont non indispensables à la survie de la cellule hôte. Les plasmides peuvent porter des gènes utiles tels que les gènes de résistance aux antibiotiques. But du TP : Extraction de l’ADN plasmidique se trouvant dans souche DH5α (pBluescript II KS) par la méthode de lyse alcaline. DH5α : une souche d’Escherichia coli (bactérie) non résistante à l’ampicilline (antibiotique). pBluescript II KS : un plasmide contentant le gène de résistance à l’ampicilline. Après transformation de la souche DH5α par le plasmide pBluescript II KS, on obtient des clones recombinants DH5α (pBluescript II KS) DH5α (pBluescript II KS) : Souche résistante à l’ampicilline contenant le plasmide pBluescript II KS.

Protocol expérimental

Clones DH5α (pBluescript II KS) obtenus sur milieu solide Milieu LBA (LB +ampicilline)

-Cultiver un clone DH5α (pBluescript II KS) dans 1 ,5 ml liquide LBA - Incuber à T=37°C et agitation 150 rpm, pendant une nuit. -Centrifuger à 5000 rpm pendant 10 min -jeter le surnageant -Resuspendre le culôt dans 100 µl solution A (25 mM tris-HCl pH 8, 50 Mm glucose ; 10 mM EDTA) par vortexage. Rôle de la solution A : Fragilisation de la membrane (début de la lyse cellulaire) L’EDTA est un chélateur d’ions (Mg2+, Ca2+) ce qui déstabilise la membrane bactérienne et inactive les DNases). -Ajouter 200 µl solution B (0,2N NaOH, 1% SDS) -Mélanger délicatement par inversion à la main et incuber 5 min à température ambiante. La solution devient visqueuse. Rôle de la solution B : SDS : détergent qui dissout et dégrade les composants lipidiques de la membrane bactérienne 

Lyse cellulaire complète

A pH basique, on a 

Dénaturation de l’ADN (séparation des deux brins)



Hydrolyse du chromosome bactérien en grands fragments mais les deux brins des plasmides restent circulaires

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Ajouter 150 µl solution C (Acétate de potassium 3 M pH 5,2)

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Mélanger délicatement par inversion du tube

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Incuber 5 min dans la glace A cette étape, il y a formation d’un précipité blanc.

Rôle de la solution C : 

L’ADN plasmidique de petite taille se rénature très vite. Il reste soluble en solution.



L’ADN chromosomique n’arrive à se rénaturer. Les fragments d’ADN simple brins se précipitent sous l’effet de la forte concentration en sels.

Précipité blanc contient ADN chromosomique hydrolysé + l’ARN de haut poids moléculaire + les protéines. -Centrifuger 5 min à 14000 rpm. -Transférer le surnageant dans un nouveau tube. - Pour une purification meilleure de l’ADN plasmidique (digestion, séquençage du plasmide par la suite) Ajouter volume/volume phénol/chloroforme -Agiter à la main pendant 5 min -Centrifuger à 14000 pendant 5 min -Récupérer la phase supérieure (aqueuse) dans un nouveau tube -Pour un volume de la solution d’ADN, ajouter 2V éthanol ou 1V isopropanol. -Agiter le tube à la main puis incuber 5 min à température ambiante - Centrifuger à 14000 rpm pendant 10 min -Jeter le surnageant et laver le culot par 300µl éthanol 70% -Sécher le culot sur la paillasse jusqu’à l’élimination totale de l’alcool -Dissoudre le culot dans 50 µl TER 10 mM TER (10 mM Tris HCl (pH 8) ; 1 mM EDTA (pH 8) ; 20 µg/ml RNase) - Incubation 1h à 37°C -Stocker la solution d’ADN à -20°C.