Proceso Histologico sb2c

Practica 3: Manejo de la lupa y Preparación de láminas Laboratorio de Biología General

Tema 1. El procesamiento histológico.              

Métodos de fijación Propiedades de los fijadores Factores implicados en la fijación Obtención de muestras y proceso histológico Microtomía Cortes vibratómicos Confección de cortes con el criostato Cortes en parafina Confección de cortes semifinos y ultrafinos (ultramicrotomía) Tipos de tinciones Interacciones de los colorantes con los tejidos Métodos de tinción Medios de montaje Seguridad en el laboratorio

Material de estudio complementario  

Webs de interés Artículos

Métodos de Fijación ¿Qué sinifica fijar un tejido u órgano? La fijación de los tejidos u órganos para su ulterior procesamiento histológico y estudio microscópico se consigue gracias al empleo de sustancias químicas que interaccionan con los componentes moleculares de los propios tejidos. Estas sustancias químicas reciben el nombre de Fijadores. En ocasiones se emplean también otras técnicas de fijación basadas en métodos físicos. ¿Por qué se tienen que fijar los tejidos? Los objetivos que se pretenden alcanzar realizando una fijación son los siguientes:  

Preservar el tejido de la putrefacción, autolisis, etc... Endurecer el tejido para permitir su manipulación y evitar alteraciones morfológicas y estructurales que pudieran ocasionarse debido al propio procesamiento histológico.

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Mantener intacta la citoarquitectura y ultraestructura. Preservar las características de las moléculas (de particular importancia para la determinación histoenzimática e inmunocitoquímica).

¿Cuántas clases de fijadores existen? Existen muchas clases de sustancias fijadoras. Una clasificación de los diferentes tipos de fijadores es la propuesta por Backer (1960):    

Aldehidos. Son algunos ejemplos: el paraformaldehido, el glutaraldehido, la acroleina y el glioxilato Agentes oxidantes. Los más utilizados: el tetróxido de osmio, el permanganato potásico y el dicromato potásico. Agentes desnaturalizantes de proteinas. Algunos ejemplos: el ácido acético, el alcohol metílico y el alcohol etílico Fijadores que actúan por mecanismos poco conocidos. Pertenecen a este grupo el ácido pícrico y el cloruro de mercurio.

¿Cómo se elige un fijador? La decisión de emplear un fijador u otro es siempre función del tipo de estudio histológico que deba realizarse. Existen soluciones fijadoras que son más adecuadas que otras para cada tipo de procesamiento y estudio. Distinguimos entonces:      

Fijación Fijación Fijación Fijación Fijación Fijación

para para para para para para

microscopía óptica microscopía electrónica estudios topográficos o morfológicos demostración de productos específicos estudios histoquímicos estudios inmunocitoquímicos

¿Cuáles son los métodos de fijación más empleados? Básicamente, los métodos de fijación pueden clasificarse en métodos físicos y métodos químicos. Los métodos físicos de fijación más empleados son:  

Fijación por calor Fijación por microondas

Los métodos químicos de fijación más empleados son: 

Fijación por inmersión. Este método consiste en tomar o extraer una muestra del tejido u órgano que se vaya a procesar y sumergirlo en una solución fijadora. Normalmente, se introduce la pieza de tejido en un frasco que contiene la cantidad adecuada de fijador.

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Fijación por vapores. Este método consiste en exponer la muestra que se pretenda fijar a la acción de los vapores del fijador. Fijación por perfusión. Este método consiste en realizar una perfusión de la solución fijadora utilizando el torrente vascular. Es el método empleado normalmente con animales de experimentación en los que se practica una perfusión cardiaca o aórtica. Con la utilización de este método se consiguen las mejores fijaciones (y por lo tanto las mejores observaciones histológicas) puesto que: Se facilita el proceso de penetración del fijador al interior de las muestras. Se evita la deformación del tejido durante la manipulación de extracción preservándose mejor la estructura de los tejidos blandos. El proceso de fijación comienza inmediatamente y se ha comprobado que de esta forma el número de células picnóticas que se observa en los tejidos es menor que utilizando otros métodos de fijación. También se ha observado que el número de mitosis observado es mayor que utilizando otros métodos. Tras la perfusión, usualmente se completa el proceso de fijación disecando las piezas objeto de estudio y fijándolas seguidamente por inmersión.

En ocasiones, pueden combinarse los métodos físicos y los químicos ya sea secuencialmente o simultáneamente. Por ejemplo se puede fijar con microondas una pieza sumergida en un fijador químico.

Propiedades de los fijadores Mecanismos de Fijación  

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Los mecanismos de acción de ciertos fijadores son poco conocidos. Es el caso de los fijadores basados en el uso de sales de mercurio. La mayor parte de los fijadores establecen entrecruzamientos con proteínas solubles y estructurales formándose, como consecuencia, un gel que mantiene una estructuración muy parecida a la observada in vivo Algunos fijadores interaccionan con los ácidos nucleicos.

Fijación de las proteínas 

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Formaldehido: entrecruzamiento con aminoácidos externos (especialmente con la lisina). Reacciones reversibles durante las primeras 24 horas. Preserva bastante tantol la capacidad antigénica como la actividad enzimática. La morfología suele ser óptima pero la ultraestructura puede ser deficiente. Glutaraldehido: formación de polímeros que establecen entrecruzamientos con las proteínas. Con el paso del tiempo los

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pol’meros se van uniendo entre sí. Reacciones rápidas e irreversibles. Puede inhibir tanto la actividad enzimática como la capacidad antigénica. Se obtiene una muy buena preservación ultraestructural.

Factores implicados en la fijación 1. Concentración del fijador La capacidad de fijación de la solución fijadora que empleemos vendrá determinada por la concentración del fijador utilizado. A mayor concentración mayor fijación. Sin embargo conviene elegir la concentración adecuada para impedir que la interacción del fijador con el tejido (efecto barrera) sea un impedimento para la entrada del fijador hacia la parte central de la muestra. Concentraciones muy elevadas del fijador pueden provocar malas fijaciones El formol comercial (35%) se utiliza normalmente diluyéndolo 10 veces para preparar la formalina. El paraformaldehido suele utilizarse en concentraciones del 2 al 4% El glutaraldehido (que se comercializa al 25%) puede utilizarse a concentración entre el 0,1 y 2,5 % 2. Tampón y pH Pueden utilizarse los fijadores en soluciones acuosas, pero para trabajos más finos es necesario que el vehículo esté tamponado a un pH determinado (en función del tipo de tejido o de la actividad enzimática que se desea determinar). La morfología y ultraestructura se mantienen aceptables dentro de un margen de pH de 6 a 8. Para tejido nervioso se recomienda generalmente un pH de 7.4 ¿Cuales son los tampones más utilizados? El tampón fosfato, el tampón cacodilato, o el tampón veronal ¿Es indiferente elegir un tampón u otro? No. Hay ciertas precauciones que hay que tener en cuenta:

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Evitar interacciones entre el fijador y el tampón (Por ejemplo: el tampón tris y los barbituratos reaccionan con los aldehidos) o Algunos tampones inhiben ciertas actividades enzimáticas mientras que otros las favorecen (Por ejemplo: el tampón fosfato inhibe la glucosa 6'-fosfato deshidrogenasa; el tampón trizma-maleato favorece la determinación enzimática de las fosfatasas) o

3. Temperatura Para muchos de los estudios que se realizan en Microscopía óptica las fijaciones suelen realizarse a temperatura ambiente. Sin embargo, para estudios Histoquímicos o Inmunocitoquímicos o cuando el objetivo es realizar un estudio en Microscopía electrónica, las fijaciones conviene realizarlas en nevera a temperatura de 0-4 grados C. En general, incrementando la temperatura, se acelera el proceso de fijación. Cuando se utilizan bajas temperaturas, hay que aumentar los tiempos de fijación. 4. Penetración de los Fijadores Cada fijador tiene un coeficiente de difusión intrínseco que indica el grado de penetración que posee, expresado en milímetros por hora. Para facilitar la penetración de los fijadores, se han de retirar todos los obstáculos que impidan su penetración (Por ejemplo, para fijar el cerebro hay que retirar las meninges). Para facilitar la fijación, las muestras se han de trocear en rebanadas lo más delgadas posibles: Para microscopía óptica, son suficientes rebanadas de 5 mm. de grosor. Para microscopía electrónica se recomienda que estas rebanadas tengan un grosor menor a 1 mm. 5. Volumen ¿Que volumen de fijador debemos usar? Para asegurarnos buenas fijaciones por inmersión es necesario que el volumen del fijador exceda en una proporción de 10:1 el volumen de las muestras. Es conveniente cambiar el fijador una o varias veces a lo largo de la fijación. 6. Osmolaridad Es importante ajustar la presión osmótica de la solución fijadora. Si la solución fijadora es isotónica (340 mOsm) o hipotónica, se produce vacuolización

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celular. Si la solución fijadora es muy hipertónica se produce una contracción del tejido con retracción celular. ¿Cual es la osmolaridad adecuada? Los mejores resultados se consiguen con una solución ligeramente hipertónica de 400 - 450 mOsm. ¿Cómo se ajusta la osmolaridad? Para ajustar la la osmolaridad de las soluciones fijadoras se recurre a la adición de determinadas sustancias como: dextranos, polivinilpirrolidona, sucrosa (>5%) o Cloruro sódico (0,9%) 7. Tiempo de Fijación Hay que ajustar cuidadosamente el tiempo de fijación en función del fijador utilizado, de su concentración, de la temperatura y del objetivo del estudio. ¿Es conveniente prolongar el tiempo de fijación? No, ya que una fijación excesiva produce efectos adversos como: Retracción del tejido; endurecimiento excesivo que dificulta la ulterior obtención de cortes; extracción de algunas moléculas; inhibición de actividades enzimáticas; pérdida de características antigénicas; y degradación general del tejido por oxidación de las proteínas.

Obtención de muestras y proceso histológico Toda muestra, ya sea procedente de una biopsia, una autopsia, o de un trabajo experimental (utilizando animales de experimentación) que deba estudiarse en el laboratorio de Histología debe estar bien identificada desde el principio. Todos los recipientes que la contengan deben estar convenientemente etiquetados con una referencia adecuada. Una vez las muestras han sido convenientemente fijadas se ha de proceder con el desarrollo del proceso histológico adecuado que permitirá la obtención de cortes. En función de las técnicas de tinción que se pretendan emplear y del tipo de estudio que se quiera realizar, las muestras se procesarán de una forma u otra.

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En ocasiones (cuando se ha de realizar un diagnóstico rápido de una biopsia, o cuando la técnica lo requiere) puede ser necesario o conveniente obtener secciones histológicas sin realizar una fijación previa. En estos casos las muestras se congelan rápidamente y se cortan con un microtomo de congelación En términos generales puede decirse que el proceso histológico pretende dar soporte o endurecer lo suficientemente las muestras para permitir la obtención de cortes delgados. Para ello puede recurrirse a la utilización de medios de encastración o medios de inclusión. Cuanto más se endurezca la pieza y el medio de soporte, más delgados podrán realizarse los cortes. En función del tipo de corte que necesitemos utilizaremos un tipo de microtomo. Consideraremos cuatro procesos histológicos básicos: Proceso histológico para obtención de cortes vibratómicos. Tras la fijación, las muestras se lavan en tampón de lavado y seguidamente pueden ser llevadas directamente al vibratomo para ser cortadas. Es un proceso rápido y sencillo. Proceso histológico para congelación. Si las muestras no han sido fijadas previamente, se procede a una congelación rápida. El agua contenida en el tejido se congela y el propio hielo sirve de sostén al tejido permitiendo que sea cortado en secciones delgadas. Para realizar la congelación pueden utilizarse aerosoles en spray (-50 C) o bien se procede a sumergir la muestra en nitrógeno líquido (-190 C), o en isopentano enfriado con nitrógeno (-150 C), o bien en dióxido de carbono (-70 C). Una vez congeladas, las muestras se pueden cortar inmediatamente en un criostato o bien pueden almacenarse en un congelador (-80 C). Si las muestras están convenientemente fijadas, tras lavar el fijador, se sumergen a temperatura de 4 C en un medio crioprotector (sucrosa al 30%) que evitará la formación de grandes cristales de hielo que pueden producir alteraciones morfológicas. Una vez ha penetrado el medio crioprotector en la muestra, la congelación puede realizarse con dióxido de carbono. Con una congelación relativamente lenta se obtienen buenos resultados. Una vez congeladas las muestras pueden cortarse con un criostato o con un microtomo de congelación, o bien pueden almacenarse en congelador (-80 C) hasta su utilización. Como precaución hay que evitar congelar muestras que han sido fijadas utilizando alcohol, cloruro de mercurio, o dicromato porque endurecen excesivamente el tejido y lo hacen quebradizo. Proceso histológico de inclusión en parafina Tras la fijación, las muestras se lavan convenientemente para retirar cualquier resto de fijador, y seguidamente se deshidratan, se aclaran y se infiltran en

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parafina. El objeto de este proceso es embeber las muestras en una sustancia como la parafina que tiene una densidad parecida a la de los tejidos y a temperatura ambiente es solida y lo suficientemente consistente para confeccionar bloques que pueden ser cortados con un microtomo. La deshidratación se suele realizar con concentraciones crecientes de alcohol, o acetona o bien dioxano: Baños sucesivos de gradación de 70%, 90% y 100% (de este último varios cambios) El aclarado se realiza usualmente con tolueno, xileno o benceno. Estas sustancias tienen la particularidad de ser miscibles tanto con el agente deshidratante como con la parafina. Al ser expuestas al agente aclarante, las muestras suelen transparentarse. La imbibición en parafina se realiza calentando ésta por encima de su punto de fusión para que esté en estado líquido y pueda infiltrarse en el interior de la muestra. Existen parafinas con diferente punto de fusión y dureza. Su elección depende de la consistencia del tejido y de la temperatura ambiente del laboratorio. Una vez infiltradas las muestras con parafina, se confeccionan bloques con moldes adecuados. Al enfriarse, la parafina se solidifica y el bloque adquiere una dureza adecuada para ser cortado con el microtomo de parafina (de deslizamiento o de rotación). Alternativamente a la parafina pueden utilizarse otros medios de imbibición como el paraplast (parafina + plastificantes). Dado que todo este proceso es largo, cuando se tienen que procesar numerosas muestras, se recurre a aparatos automáticos denominados "Autotecnicones" que pueden programarse para que realicen los diferentes baños de forma automática. Las muestras siguen todo el proceso en el interior de unas cápsulas o casettes convenientemente agujereados que permiten el intercambio de líquidos. Los bloques de parafina pueden almacenarse indefinidamente hasta que son cortados. Proceso histológico de inclusión en resinas plásticas. Tras la fijación adecuada, se sigue un proceso muy similar al descrito para la inclusión en parafina, pero con más pasos intermedios. El objeto final el embeber las muestras en un producto plástico, generalmente una resina, como la Araldita o el Epon que una vez han polimerizado forman una estructura dura que permite la obtención de cortes muy delgados (semifinos y ultrafinos) utilizando un microtomo especial denominado ultramicrotomo. Los bloques de resina pueden almacenarse durante años hasta su utilización

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Microtomía ¿Qué es un microtomo? Un microtomo es un aparato mecánico de precisión que consta usualmente de un soporte para colocar la muestra que hay que cortar y una cuchilla de acero o vidrio que permite realizar los cortes. ¿Cuantos tipos de microtomos existen? Existen diversos tipos y modelos de microtomos que permiten la obtención de cortes de diferentes grosores en función de las técnicas histológicas que se tengan que realizar. Una clasificación es la siguiente: 

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Vibratomos: Cortes gruesos (30- 100 µm). Los vibratomos disponen de una cubeta donde la muestra permanece sumergida constantemente en una solución (usualmente un tampón de lavado). Una cuchilla vibrante realiza las secciones que permanecen en el interior de la cubeta. Microtomos de congelación y criostatos: Cortes delgados (8-30 µm). Los microtomos de congelación son aparatos relativamente sencillos que están conectados a una bombona de dióxido de carbono. Una cuchilla de acero deslizante permite la obtención de cortes delgados que se manejan con un pincel o aguja enmangada. Los criostatos constan de una cámara refrigerada en cuyo interior queda alojado un microtomo de rotación. Mediante una manivela o un mecanismo automatizado se controla el movimiento y avance de la muestra. Los cortes quedan sobre una cuchilla metálica y se manipulan con pincel o aguja. Microtomos de parafina (de rotación y de deslizamiento): Cortes muy delgados (5 - 10 µm). En los microtomos de rotación, la muestra sujeta a un brazo movil se va cortando con ayuda de una manivela rotatoria. Los cortes se obtienen en tiras que pueden manipularse con pincel o aguja. En los microtomos de deslizamiento, la muestra permanece fija y es la cuchilla la que se desliza hasta alcanzar la muestra. El microtomo de deslizamiento se utiliza generalmente para obtener secciones histológicas de gran superficie. Ultramicrotomos: Cortes semifinos (1-3 µm) y ultrafinos (50-100 nm). Son aparatos muy precisos totalmente automátizados en los que el avance de la muestra es muy preciso y suele estar controlado térmicamente. Las cuchillas son de vidrio o de diamante. Los cortes que se obtienen quedan flotando en la superficie del agua que hay en un receptáculo acoplado a la cuchilla. La manipulación de los cortes es crítica y se realiza con un pelo delgado o con una barilla de vidrio.

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Cortes vibratómicos La ventaja de obtener cortes vibratómicos es que el tejido permanece durante todo el proceso en un medio acuoso, sin sufrir deshidratación alguna lo cual preserva de forma óptima las actividades enzimáticas y las características antigénicas. Los cortes se toman de la cubeta del vibratomo con un pincel y se van guardando en botes que contienen tampón de lavado. Pueden obtenerse cortes seriados relativamente gruesos que pueden procesarse para técnicas histoquímicas e inmunocitoquímicas "en flotación". Los cortes vibratómicos una vez procesados histoquímica o inmunocitoquímicamente, pueden incluirse a continuación en resina o plástico y ser procesados para Microscopía electrónica. La obtención de cortes vibratómicos es relativamente sencilla, pero es un proceso lento.

Confección de cortes con el criostato Para obtener buenos cortes con un criostato a partir de tejidos sin fijar se precisan temperaturas de trabajo bastante bajas (alrededor de -25 C). Los tejidos fijados se cortan a temperaturas superiores (alrededor de -10 C). En cualquier caso debe ajustarse la temperatura óptima en función de las características de cada tejido. Los cortes de criostato se recogen directamente sobre portaobjetos que pueden procesarse directamente o guardarse en el congelador a -80 C. También pueden recogerse en botes con tampón de lavado donde permanecen hasta su utilización, pero si se tienen que almacenar durante mucho tiempo es recomendable mantenerlos a -20 C y utilizar un medio que contenga un agente crioprotector (solución de Olmos). Los cortes de criostato pueden utilizarse para la mayor parte de técnicas de tinción rutinarias y son especialmente útiles para desarrollar técnicas histoquímicas e inmunocitoquímicas. Son útiles también para la demostración de sustancias solubles que no resisten el proceso de deshidratación como son los lípidos. Sin embargo no pueden emplearse estos cortes para ser

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procesados ulteriormente para microscopía electrónica ya que la ultraestructura resulta dañada por el propio proceso de congelación y corte. La obtención de cortes con el criostato es una técnica rápida en comparación con la de obtención de cortes en parafina. Es ampliamente utilizada cuando se precisa estudiar una biopsia y dar un diagnóstico rápido.

Cortes en parafina. Los cortes de parafina constituyen la forma usual de trabajo en un laboratorio de histología. Los cortes, relativamente delgados, pueden recogerse fácilmente de forma seriada. Los cortes, que se manejan con ayuda de un pincel o aguja enmangada, se depositan sobre la superficie de un baño de agua caliente (38 C) donde con el calor se estiran convenientemente. Seguidamente se recogen sobre portaobjetos tratados con gelatina, albúmina o poli L- lisina y se dejan secar en una estufa para que se adhiran al vidrio. La realización de cortes de parafina exige experiencia y paciencia. Para poder teñir los cortes de parafina es necesario proceder a retirar previamente la parafina, lo cual se consigue bañando los portaobjetos con los cortes en un disolovente de la parafina, usualmente xilol. Los cortes de parafina se emplean para una gran cantidad de técnicas de tinción, ya sea topográficas o específicas. También pueden realizarse algunas técnicas histoquímicas e inmunocitoquímicas.

Confección de cortes semifinos y ultrafinos (ultramicrotomía) Los cortes semifinos obtenidos con un ultramicrotomo se "pescan" de la superficie del agua de la balsa de la cuchilla de vidrio con una barilla. El portaobjetos se coloca en una placa caliente y los cortes quedan adheridos al vidrio. Los cortes semifinos se pueden teñir directamente con soluciones colorantes adecuadas o bien ha de procederse a retirar previamente la resina plástica mediante la exposición a un disolvente adecuado. Tras su tinción los cortese semifinos constituyen un excelente material de estudio en microscopía óptica.

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Los cortes ultrafinos se recogen sobre rejillas de cobre con ayuda de un pelo delgado. Las rejillas se guardan en un portarejillas. Tras su contraste, los cortes ultrafinos se observan con un microsocopio electrónico de transmisión. La confección de cortes semifinos, y sobre todo de cortes ultrafinos, requiere una gran preparación técnica, experiencia y habilidad.

Tipos de tinciones Existen múltiples métodos de tinción histológica, unos generales y otros específicos, que permiten poner de manifiesto tanto la topografía tisular, como tipos celulares concretos, determinados orgánulos o estructuras intracelulares. Las tinciones histológicas propiamente dichas utilizan colorantes, la mayor parte de ellos derivados de la industria textil, que se eligen en función de su capacidad de interaccionar con los diferentes constituyentes de los tejidos. Técnicas de tinción más complejas como las histoenzimáticas o inmunocitoquímicas se basan en el empleo de sustratos, lectinas, anticuerpos, etc. ¿Que es un colorante? Un colorante es una molécula que tiene la capacidad de absorber radiaciones electromagnéticas dentro de la región del espectro visible es decier entre 400 y 650 nm. Los colorantes que absorben todas las radiaciones entre estos márgenes, no transmiten ningún tipo de luz y se ven por lo tanto de color negro. Aquellos colorantes que absorben una franja más estrecha, transmiten un color determinado. Por ejemplo el ácido pícrico absorbe predominantemente la luz azul-violeta del final del espectro visible, dando como resultado una luz transmitida de color amarillo. ¿Cuándo se habla de un buen método de tinción? Un buen mŽtodo de tinci—n es aquel que cuando se reproduce da un alto porcentaje de Žxito con resultados equiparables. Todos lo mŽtodos de tinci—n requieren siempre una adapataci—n o modificaci—n para ser utilizados correctamente. Para reproducir un método de tinción hay que utilizar siempre reactivos, colorantes y agua destilada de calidad y preparar las soluciones colorantes en material de vidrio extremadamente limpio. Conviene tener presente que la técnica de tinci—n en sí misma no es una tŽcnica aislada sino que forma parte integral de todo el proceso histol—gico.

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Los protocolos de tinción deben escribirse de forma concisa, anotando de forma muy precisa indicando claramente todos los pasos necesarios para preparar todas las soluciones empleadas, tiempos de actuación, temperatura, condiciones, etc... ¿Puede la fijación interaccionar con la técnica de tinción? Los diferentes fijadores interactúan de forma diferente sobre las moléculas que componen los tejidos produciendo modificaciones. En un mismo tejido, los colorantes se comportan de forma diferente en funci—n del grado de fijación y de la naturaleza del fijador utilizado. Por ejemplo, se conoce que tanto la formalina como el tetr—xido de —smio inducen basofilia en los tejidos, mientras que las soluciones colorantes a base de dicromato inducen acidofilia. En comparaci—n con la formalina, el fijador de Carnoy incrementa la avidez del tejido por los colorantes, mientras que el fijador de Zenker disminuye el grado de coloraci—n. ¿Que es una tinción progresiva y una tinción regresiva? Una tinción progresiva es aquella en las que los cortes histológicos se sumergen en la solución colorante durante el tiempo necesario hasta que adquieren el grado de tinción deseada. Cuanto más tiempo están los cortes en la solución colorante, más fuerte es la tinción. Una tinción regresiva es aquella en la que los cortes se "sobretiñen" dejándolos en la solución colorante durante un tiempo excesivo y posteriormente se procede a retirar el exceso de colorante (proceso que se llama "diferenciación") mediante tratamiento con una solución ácida o alcohólica. En este caso se ajusta el tiempo de diferenciación. ¿Qué diferencia hay entre una tinción física y una tinción química? En una tinción física, el colorante se disuelve en el sustrato. Por ejemplo el Sudán III se disuelve en las grasas, y es empleado para demostrar gotas lipídicas. En una tinción química, el colorante interacciona químicamente con el sustrato a través de fuerzas de van der Waals, puentes de hidrógeno, enlaces covalentes o enlaces electrostáticos. ¿Qué es una tinción directa y una indirecta? En una tinción directa el colorante interacciona directamente con el sustrato. En una tinción indirecta se hace interaccionar en primer lugar a una sustancia química denominada "mordiente" con el sustrato la cual permite la posterior interacción del colorante. Usualmente los mordientes son sales, hidróxidos o alumbres de metales bivalentes o trivalentes. ¿Qué es una tinción tricrómica?

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Las tinciones pueden ser simples cuando se utiliza un solo colorante, o múltiples cuando se usan dos o más colorantes. En una tinción tricrómica se emplean tres colorantes, cada uno de ellos con unas particularidades, de tal manera que se consigue teñir con colores diferentes, estructuras diferentes, permitiendo así su rápida identificación en el microscopio. ¿Qué es una tinción supravital? Es aquella que se realiza sobre células frescas, recién obtenidas, con objeto de realizar una observación de las estructuras teñidas con las células vivas. Por ejemplo, se puede teñir las mitocondrias de células vivas con el colorante Verde Jano y observarlas con el microscopio mientras las células permanecen vivas. ¿Qué es una tinción vital? Es aquel procedimiento por el cual un colorante no-tóxico, como el Carmín de litio o el Azul Tripán, se inyecta en un organismo vivo para estudiar procesos vitales de células capaces de acumularlo por pinocitosis o fagocitosis. ¿En qué consiste una tinción negativa? Esta forma de tinción se basa en que el colorante no-tiñe la estructura que se desea estudiar, de tal forma que la morfología externa o los contornos de esa estructura quedan delimitados por el propio colorante que se encuentra a su alrededor. ¿Qué es una tinción de cortes "en flotación"? Usualmente los cortes histológicos se montan sobre portaobjetos antes de ser teñidos lo cual facilita su manipulación. Sin embargo en ocasiones, sobre todo cuando se utilizan cortes gruesos de 30-50 micras, obtenidos con un criostato o con un vibratomo, conviene realizar determinado tipo de tinciones "en flotación". Para ello los cortes de tejido se mantienen sumergidos (en flotación) en el interior de la solución colorante lo cual permite la accesibilidad del colorante por ambas superficies. Este tipo de técnica es poco común cuando se utilizan colorantes pero es habitual cuando se realizan técnicas de tinción histoenzimáticas o inmunocitoquímicas. ¿Qué es una tinción en placa? Es aquella que se realiza utilizando placas de cultivo celulares. Es decir, la tinción se realiza sobre células que se han mantenido vivas en condiciones in vitro. ¿En qué consiste una tinción "en bloque"?

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En ocasiones, en algunos tipos de impregnaciones metálicas, técnicas de Golgi, etc... conviene realizar la tinción no sobre cortes histológicos sino sobre la pieza o bloque de tejido. Para ello el bloque de tejido se sumerge en la solución colorante durante un tiempo determinado. Los resultados finales no se pueden valorar, sin embargo, hasta que no se han confeccionado los cortes y se realiza la observación microscópica. ¿Qué es una tinción para microscopía electrónica? Para la observación de los cortes ultrafinos con el microscopio electrónico de transmisión, es preciso "contrastar" los cortes con objeto de incrementar las diferencias de densidad electrónica de las diferentes partes de la muestra. Para ello se recurre al emleo de sales de metales pesados como uranio, wolframio o plomo. ¿Qué es una tinción histoenzimática? El objetivo de una tinción histoenzimática es detectar la presencia de un enzima. Para ello se recurre a una serie de reacciones químicas que demuestran la presencia del producto de la actividade enzimática. ¿Qué es una tinción inmunocitoquímica? Las tinciones inmunocitoquímicas o inmunohistoquímica pretenden detectar la presencia de una molécula con características antigénicas. Para ello se recurre al empleo de anticuerpos que interaccionan directamente con los antígenos. Estos anticuerpos pueden estar marcados con una sustancia fluorescente y en este caso se trata de una tinción de inmunofluorescencia.

Interacciones de los colorantes con los tejidos Los colorantes interaccionan con las moléculas componentes de las estructuras celulares y tisulares a través de alguno o varios de los siguientes tipo de interacciones: 

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Fuerzas de van der Waals. Son fuerzas de atracción de corto alcance y de gran importancia en la interacción de los sustratos hidrofóbicos con las estructuras aromáticas de los colorantes. Es importante por ejemplo en la tinción de las fibras elásticas (compuesta por la proteina elastina que es hidrofóbica) por colorantes como la orceína cuyo componente activo presenta anillos aromáticos. Puentes de Hidrógeno. Tienen gran importancia cuando el solvente del colorante es no-acuoso. Un ejemplo es la interacción que se produce

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entre el colorante carmín de Best y el glucógeno, tinción que se lleva a cabo utilizando metanol como solvente. Enlaces covalentes. Se producen por ejemplo en los sistemas de tinción que emplean iones metálicos como mordiente entre el colorante y el tejido. Uniones electrostáticas (de Coulomb). Son las más frecuentes y se producen entre las estructuras tisulares cargadas positiva o negativamente con los aniones o cationes respectivamente de los colorantes iónicos.

Clasificación de los colorantes Los colorantes pueden clasificarse en iónicos y no-iónicos (o hidrofóbicos). A su vez, los colorantes iónicos se clasifican en ácidos, básicos y neutros. ¿Qué es un colorante iónico ácido? Es aquel que cuyo principio colorante es aniónico (carga negativa) y tiene por lo tanto afinidad por las estructuras tisulares cargadas positivamente. Estas estructuras tisulares se dice que son acidófilas. ¿Qué es un colorante iónico básico? Es aquel que cuyo principio colorante es catiónico (carga positiva) y tiene por lo tanto afinidad por las estructuras tisulares cargadas negativamente. Estas estructuras tisulares se dice que son basófilas. ¿Que es un colorante iónico neutro? Es aquel que tiene un principio colorante aniónico (carga negativa) y otro principio colorante catiónico (carga positiva) ¿Que significa metacromasia? Un colorante presenta metacromasia cuando tiñe ciertas estructuras de un color diferente al suyo propio. Por ejemplo, el azul de toluidina que tiñe las estructuras normalmente de color azul (tinción ortocromática) presenta metacromasia cuando tiñe los gránulos de los mastocitos, de color rojo. Esta propiedad de algunos colorantes se debe a que en algunas circunstancias los monómeros forman dímeros que presentan un color diferente.

Métodos de tinción Metodología general de tinción de cortes en parafina

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Para teñir cortes en parafina, debe procederse en primer lugar a eliminar la parafina puesto que no existe ningún colorante que pueda teñir a través de ésta. Para ello se recurre al proceso inverso al utilizado durante la elaboración de los bloques de parafina. Es decir, en primer lugar se procede a una desparafinación mediante el empleo de un disolvente de la parafina como pueda ser el xilol. A continuación se procede a una hidratación mediante baños sucesivos de alcohol en gradación decreciente. Una vez en medio acuoso, se pueden emplear colorantes hidrosolubles. Metodología general de tinción de cortes en congelación y vibratómicos. Los cortes en congelación y vibratómicos, puesto que ya están hidratados, pueden teñirse directamente con colorantes hidrosolubles.

Medios de montaje Para observar adecuadamente los cortes teñidos con el microscopio óptico, se ha de proceder a cubrir las preparaciones mediante un cubreobjetos. Para ello se requiere la utilización de una sustancia cementante o medio de montaje. Si se quiere asegurar la estabilidad de la tinción histológica, se utiliza unl medio de montaje permanente que se ha de elegir en función del tipo de técnica de tinción empleada. Si durante la técnica de tinción se han empleado colorantes hidrosolubles, deben utilizarse medios de montaje no-acuosos, es decir hidrofóbicos. Consecuentemente, los cortes han de volverse a deshidratar y tratarse con un disolvente del medio de montaje antes de aplicar éste. Si por el contrario, los colorantes utilizados son no-iónicos, es preceptivo utilizar un medio de montaje hidrosoluble. Antes de su aplicación, los cortes deben hidratarse convenientemente.

Seguridad en el laboratorio (Preparado por Isabel Venteo Valverde (alumna del curso 98-99) 

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Todo accidente en el laboratorio ser‡ descrito e investigado con informes. Los procedimientos de seguridad en caso de incendio estar‡n expuestos a la vista. El equipo de seguridad (extintores, mantas y alarmas) tendr‡ f‡cil . TambiŽn estar‡n disponibles duchas y lavadores de ojos.

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El laboratorio estar‡ bien ventilado, controlando los niveles de formol e hidrocarbonos (xileno y tolueno). Todo instrumento deber‡ tener instrucciones sobre funcionamiento y seguridad durante su utilizaci—n. Habr‡ archivos de todos los compuestos qu’micos usados, indic‡ndose la naturaleza, toxicidad y precauciones de uso. El laboratorio dispondr‡ de medios para depositar los restos peligrosos: los tejidos deber‡n ser almacenados en formol y nos desharemos de ellos inciner‡ndolos o tir‡ndolos a una trituradora de tejidos conectada a un amplio alcantarillado para depositar basuras. A menudo se contratan compa–’as que se encargan de estos residuos. Los materiales inflamables estar‡n en vitrinas especialmente dise–adas y almacenados en habitaciones autorizadas. Determinados riesgos que se deben conocer: El ‡cido p’crico de la soluci—n de Bouin es explosivo en forma no hidratada. Cuando las soluciones que contengan acida sódica sean eliminadas por el desguace lavaremos Žste dejando correr mucha agua para evitar que esta reaccione con el metal de las ca– er’as y lo haga explosivo. o Los compuestos con bencidina, benceno, antraceno y naftol son cancer’genos. Evitar su uso. o Las soluciones de mercurio tienen su propio contenedor. Si se tiran por el desagüe se forman resistentes amalgamas con el metal de las ca–er’as. o

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Proceso Histologico sb2c

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