Td Biochimie Tp Série 2 4f1b72

TD préparatoire aux TP de biochimie 2ème série 1ère année IUT GB

Stéphane Goulaouic, d’après Laurent Foucaud

Présentation des TP Série de TP centrée sur les protéines Caractérisation Détermination de leur activité enzymatique

 5 séances de TP TP tournants (sauf TP 3 : 1ère semaine)

Consignes pour les TP Elles sont identiques à celles de la première série ! Il faut avoir étudié le protocole avant de venir Indiquer les points essentiels sur son cahier de paillasse, A chaque séance le matériel nécessaire est : cahier de

paillasse, calculatrice, papier millimétré

Une évaluation en cour de séance est réalisée par

l’enseignant, des erreurs graves de manip, un mauvais comportant, un poste de travail et une salle sale entraîneront un retrait de points

Consignes pour les TP Les comptes rendus de la séance sont à rédiger

pour la séance suivante (aucun retard ne sera accepté, sous peine de perte de points)  soit une semaine Dans le compte rendu il n’est pas nécessaire de

rappeler le protocole, on précise le but de la manipulation et on apporte un soin particulier à la présentation des résultats et à leur interprétation

TP 1 et 2 : Séparation et caractérisation TP 1 : Techniques de chromatographie TP 2 : Séparation de protéines par électrophorèse

TP 1 : Les techniques de chromatographie  La chromatographie est une méthode d'analyse qui sépare les

constituants d'un mélange par entraînement à l'aide d'une phase mobile liquide ou gazeuse (éluant) le long d'une phase stationnaire solide ou liquide qui porte les solutés à traiter

 La vitesse de migration d’une substance est la résultante de 2 forces :  migration due à la solubilité dans l'éluant  rétention due à l'affinité dans la phase fixe

 La résultante de ces deux forces

étant variable selon le produit concerné, celui-ci migrera donc à une vitesse caractéristique

A

Migration Rétention

B

TP 1 : Les techniques de chromatographie  Chromatographie sur couche mince (CCM)  Repose sur des phénomènes d’adsorption :

la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants,  elle progresse le long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou d’aluminium. 

TP 1 : Les techniques de chromatographie CCM Couvercle

Front d’élution

Cuve

Phase stationnaire A B C X

Phase mobile (solvant de migration)

(plaque de silice)

TP 1 : Les techniques de chromatographie La phase mobile utilisée est la suivante :  Buthanol 16 mL  Acide acétique 8 mL  Eau 4 mL  Caractériser ce mélange Le mélange est constitué de solvants organiques très polaires (un alcool et un acide), ils vont donc facilement entraîner les molécules hydrophiles notamment les molécules polaires.  Structure générale des acides aminés 

- Molécule hydrophile plutôt polaire - Caractère plus ou moins polaire en fonction du radical

TP 1 : Les techniques de chromatographie 4 standards : AA basique ionisable, il est polaire également mais plus gros

L’acide aminé le plus simple, il est très polaire et petit Histidine

Glycine

Proline

La proline est un AA non polaire et petit, c’est un cas particulier (la coloration avec la ninhydrine est différente des autres)

Acide glutamique

est très polaire avec une fonction acide supplémentaire, cette fonction est même ionisable.

TP 1 : Les techniques de chromatographie La gel filtration sur colonne  Le gel est un séphacryl (polyholoside à très haut

poids moléculaire) qui gonfle en solution

 Il forme ainsi des mailles plus ou moins grosses de

tailles variables dans lesquelles les protéines vont pouvoir circuler

 On sépare des molécules dans une certaine gamme

de poids moléculaire

 Si les molécules absorbent à une longueur d’onde

commune, on peut toute les mesurer au spectrophotomètre cela permet d’identifier les fractions qui contiennent les molécules séparées dans chaque fraction

TP 1 : Les techniques de chromatographie  Composés à séparer  bleu Dextran (très grosse molécule 2000 kDa, polysaccharide)  hémoglobine (PM 68 kDa)  catalase (PM 220 kDa)  Quel sera le comportement du bleu Dextran dans la

colonne ?

 il ne va pas pénétrer dans le gel et donc il sortira très vite  il permet donc d’évaluer le volume mort ou le volume d’exclusion

de la colonne (le liquide qui ne se trouve pas dans le gel)

TP 2 : Séparation de protéines par électrophorèse  Principe  L’électrophorèse permet de séparer les protéines d’un mélange

(en principe selon les charges sous l’effet d’un courant électrique)

 Dans le cas présent les protéines seront séparées en fonction de

leur masse moléculaire

 En comparant la migration d’un échantillon de protéines

inconnues avec celle d’un standard on peut déterminer la masse moléculaire relative des protéines contenues dans l’échantillon

 Que signifie SDS - PAGE ?  Sodium dodécyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis  Il s’agit donc d’une électrophorèse dans un gel de polyacrylamide

(qui constitue un tamis moléculaire) en conditions dénaturantes

TP 2 : Séparation de protéines par électrophorèse Effet du SDS et du β-mercaptoéthanol sur les protéines ? 

Le SDS est un détergent, il dénature les protéines et les charge négativement pour permettre une migration selon la taille et non pas la charge Le β-mercaptoéthanol rompt les ponts disulfures. Le chauffage dénature aussi les protéines

Les protéines sont dénaturées : elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native

Les protéines n'ont plus de pont disulfure : elles sont sous une forme monomérique

TP 2 : Séparation de protéines par électrophorèse  Le gel de polyacrylamide est

obtenu par polymérisation  Plus le pourcentage

d'acrylamide est élevé, plus la densité des chaînes est élevée et les mailles du réseau sont serrées

_

En conséquence : le % d'acrylamide est élevé,

+

Pourcentage d'acrylamide

Gamme de séparation en kDa

7,5

45 - 400

10

22 - 300

12

13 - 200

15

2,5 - 100

les molécules volumineuses peuvent migrer

une protéine globulaire (assimilable à une sphère) migre d'autant moins sa masse molaire est élevée

que

TP 2 : Séparation de protéines par électrophorèse Détermination de la masse molaire d'une protéine

mobilité relative =

distance de migration d'une bande ------------------------------------------------distance de migration du front

TP 3 : Dégradation de l’eau oxygénée par la catalase •

But : étudier la cinétique de dégradation de l’eau oxygénée par la catalase mais aussi d’évaluer l’influence de la concentration en enzymes sur cette cinétique

 Les enzymes : des catalyseurs biologiques de réactions

biochimiques

 Vitesse initiale de réaction (apparition du produit) :

= k [S]

TP 3 : Dégradation de l’eau oxygénée par la catalase  Comment déterminer le temps de mesure d’une réaction enzymatique,

comment évolue la quantité de substrats au cours du temps ?  Le corollaire comment évolue la quantité de produit ?  Dans la grande majorité des cas, la

formation du produit est un phénomène exponentiel d'où la forme des cinétiques enzymatiques  L'amortissement en fin de cinétique

résulte de la disparition du substrat voire de l'accumulation du produit et, en conséquence, de la diminution de la vitesse de la réaction enzymatique

TP 3 : Dégradation de l’eau oxygénée par la catalase  Comment déterminer le temps de mesure d’une réaction enzymatique,

Comment évolue la quantité de substrats au cours du temps ?  Le corollaire comment évolue la quantité de produit

 La pente de la tangente à

l'origine de la cinétique (d[P] / dt) s'appelle la vitesse initiale de la réaction enzymatique, vi

α

TP 3 : Dégradation de l’eau oxygénée par la catalase

 Le substrat doit –il être limitant ou en excès pour déterminer l’activité

d’une enzyme ?  Qu’en est-il en terme d’application analytique ?

Dosage de l’enzyme substrat en excès

Dosage du substrat substrat limitant

(mesure cinétique)

(mesure en point final)

TP 3 : Dégradation de l’eau oxygénée par la catalase Au préalable on vous demande : • D’écrire la réaction de dégradation de l’eau oxygénée au cours du dosage • Déduire la relation entre le volume de permanganate versé et la concentration en eau oxygénée restante

 Vous devez donner les tableaux de résultats  Un graphe de la concentration en eau oxygénée restante

en fonction du temps : il s’agit de traduire la consommation du substrat par l’enzyme

 Dans un deuxième temps pour différentes concentrations

d’enzymes vous allez tracer sur un graphe la variation de substrat en fonction du temps : il s’agit de traduire les vitesses pour chaque quantité d’enzyme

 Enfin pour chaque quantité d’enzyme, on calcule la vitesse

et on traduit sur un graphe v= f(quantité d’enzyme)

TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline  Si le produit d'une réaction enzymatique possède une propriété physico-

chimique qui permet de le quantifier au fur et à mesure qu'il est formé, on peut suivre sa cinétique de formation  Les conditions optimales pour

l’étude de la phosphatase alcaline devront être déterminées :  vitesse initiale  Vm et Km  effet du pH

 Vm est la vitesse maximale de

l'enzyme dans les conditions de l'expérience quand elle est saturée en substrat  Km est la concentration de substrat qui permet d'obtenir la moitié de la vitesse maximale. C'est aussi une bonne approximation de l'affinité de l'enzyme pour son substrat

TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline

3

2 1

TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline

3 2 1

TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline

TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline

Les facteurs influençant la réaction enzymatique  pH  Aux valeurs extrêmes, il dénature, donc désactive la protéine en modifiant l’état

d’ionisation des chaînes latérales des acides aminés  Aux valeurs intermédiaires, il influe sur l’activité en modifiant l’état d’ionisation des acides aminés du site actif et celui du substrat -> courbe en cloche, en général Vi max pour des pH voisin de la neutralité  Température  Accélère les réactions en fournissant l’énergie nécessaire au franchissement de la

barrière due à l’énergie d’activation  Dénature progressivement (et désactive) les protéines (struct 2aire et 3aire ) -> courbe dissymétrique, la vitesse est multipliée par deux tous les 10 °C jusqu’à une température optimale, puis diminue rapidement  Les inhibiteurs  Ils ralentissent la vitesse de réaction jusqu’à la stopper

TP 5 : Activité spécifique de la β -fructosidase  Le but du TP est de déterminer l’activité spécifique de la β -

fructosidase, une enzyme qui catalyse la transformation du saccharose dextrogyre en un mélange équimoléculaire de glucose et fructose qui est lévogyre, ce qui lui a valu le nom de sucre inverti

 Mais aussi de tester l’effet d’un inhibiteur sur cette réaction enzymatique  L’unité

enzymatique est la quantité d’enzyme qui catalyse la transformation de 1 micromole de substrat en une minute à 25°C dans les conditions optimales de pH et de concentration en substrat. Si on rapporte l’unité enzymatique à la masse de protéines (en générale au milligramme), on a l’activité spécifique

Les facteurs influençant la réaction enzymatique Les inhibiteurs : ils ralentissent la vitesse de réaction

jusqu’à la stopper. Réversibles 

Compétitifs = analogues structuraux du substrat

1. Les inhibiteurs compétitifs  Ils se lient de manière réversible au site actif de l'enzyme et en bloquent l'accès au substrat. Ils diminuent donc la concentration d'enzyme libre ([E]). En général ils ressemblent chimiquement au substrat. D'ailleurs, si une enzyme a plusieurs substrats possibles, ceux-ci peuvent aussi agir comme inhibiteurs compétitifs réciproques.

Les facteurs influençant la réaction enzymatique Les inhibiteurs : ils ralentissent la vitesse de réaction

jusqu’à la stopper. Réversibles 

Compétitifs = analogues structuraux du substrat



Non compétitifs = non analogues, se fixent sur un autre site

2. Les inhibiteurs non-compétitifs  Ils se lient de manière réversible ailleurs qu'au site actif de l'enzyme et n'en empêchent pas l'accès. Il s'agit donc d'inhibiteurs allostériques, c'està-dire agissant à un autre (allo-) site.  Le Km reste constant, mais il y a perte apparente de concentration d'enzyme, donc réduction de vmax.

Les facteurs influençant la réaction enzymatique Les inhibiteurs : ils ralentissent la vitesse de réaction

jusqu’à la stopper. Réversibles 

Compétitifs = analogues structuraux du substrat



Non compétitifs = non analogues, se fixent sur un autre site



Inhibiteurs mixtes

3. Inhibiteurs incompétitifs

Les facteurs influençant la réaction enzymatique  Les inhibiteurs : ils ralentissent la vitesse de réaction jusqu’à la

stopper.  Réversibles  Compétitifs = analogues structuraux du substrat 

Non compétitifs = non analogues, se fixent sur un autre site



Inhibiteurs mixtes

 Irréversibles = liaison covalente au groupe fonctionnel

indispensable à l’activité catalytique