L’alcaloide Vegetale Voacamina Esercita Un Effetto Chemiosensibilizzante Su Cellule Tumorali Farmacoresistenti Mediante L’induzione Del Processo Autofagico 202i2k

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI ROMA “LA SAPIENZA”

FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI

Corso di Laurea Specialistica in Biologia Applicata alla Ricerca Biomedica

TESI DI LAUREA

L’alcaloide vegetale Voacamina esercita un effetto chemiosensibilizzante su cellule tumorali farmacoresistenti mediante l’induzione del processo autofagico

CANDIDATO: PASQUALE LISTA Matricola n. 689777 RELATORE INTERNO: Prof.ssa ENZA PICCOLELLA Dipartimento di Biologia Cellulare e RELATORE ESTERNO: Dr. GIUSEPPE ARANCIA Dipartimento Tecnologie e Salute Istituto

ANNO ACCADEMICO 2007-2008

L’alcaloide vegetale Voacamina esercita un effetto chemiosensibilizzante su cellule tumorali farmacoresistenti mediante l’induzione del processo autofagico

Pasquale Lista

Narcissus - Self Publishing made serious

Edizione digitale: febbraio 2012

ISBN: 9788863696608

Edizione digitale realizzata da Simplicissimus Book Farm srl

INDICE

1. INTRODUZIONE 1.1 Polifarmacoresistenza (Multidrug resistance, MDR) 1.2 Molecole di trasporto 1.3 La P-glicoproteina 1.4 Modulazione della MDR mediata dalla P-gp ed effetto chemiosensibilizzante 1.5 Impiego di sostanze naturali quali agenti chemioterapici 1.6 La Voacamina 1.7 Tipi di morte cellulare 1.7.1 Apoptosi 1.7.1.1 Segni morfologici 1.7.1.2 Marcatori biochimici dell’apoptosi 1.7.2 Necrosi 1.7.3 Autofagia

2. SCOPO DEL LAVORO

3. MATERIALI E METODI

3.1 La Voacamina 3.2 Colture Cellulari 3.3 Reagenti 3.4 Anticorpi utilizzati 3.5 Test di clonogenicità per la valutazione della sopravvivenza dopo trattamento con la combinazione VOA/DOX 3.6 Cenni sulla microscopia elettronica a scansione (SEM) 3.7 Cenni sulla microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e metodo di preparazione dei campioni 3.8 Freeze-fracturing 3.9 Cenni sulla Microscopia confocale 3.10 Cenni sulla citofluorimetria 3.10.1 Marcatura della P-gp mediante anticorpo UIC2 3.10.2 Analisi del ciclo cellulare 3.10.3 Quantificazione dell’apoptosi attraverso marcatura Annessina V-FITC 3.10.4 Analisi morfologica dell’apoptosi tramite marcatura con DAPI 3.10.5 Marcatura dei vacuoli autofagici con la monodansilcadaverina (MDC) 3.11 Western blotting 3.12 Analisi statistica

4. RISULTATI 4.1 Effetto della VOA sulla citotossicità indotta dalla DOX

4.2 Osservazioni al Microscopio Elettronico a Scansione (SEM) 4.3 Effetto della VOA sulla conformazione della P-gp delle cellule resistenti 4.4 Caratterizzazione della morte cellulare indotta in seguito a trattamento voacamina/doxorubicina 4.5 Effetto della VOA sulla sopravvivenza di cellule di osteosarcoma ed alterazioni morfologiche correlate 4.6 Analisi della possibile induzione dell’apoptosi nelle cellule di osteosarcoma trattate con VOA 4.7 La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) rivela la formazione di autofagosomi in cellule di osteosarcoma trattate con VOA 4.8 Rivelazione della presenza di organelli vescicolari acidici (AVOs) in cellule di osteosarcoma trattate con VOA 4.9 Conversione di LC3 indotta dalla VOA

5. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI

6. BIBLIOGRAFIA

1. INTRODUZIONE

La chemioterapia, insieme alla radioterapia e alla chirurgia, rappresenta ancora oggi una delle strategie maggiormente adottate nella lotta contro il cancro. Tuttavia, nonostante i progressi registrati negli ultimi anni nell’ottimizzazione dei protocolli terapeutici, l’efficacia della chemioterapia è spesso ostacolata per diversi motivi, tra i quali:

• la difficoltà di veicolare l’agente citotossico nella sede tumorale;

• l’incapacità del farmaco di colpire selettivamente le cellule tumorali di un tessuto o di un organo;

• l’instaurarsi del fenomeno della polifarmacoresistenza che rende le cellule tumorali insensibili al trattamento.

I farmaci utilizzati in chemioterapia, pur avendo l’obiettivo comune di distruggere la massa tumorale, agiscono su diversi bersagli cellulari e con diversi meccanismi.

Gli agenti alchilanti per esempio, esercitano effetti citotossici attraverso il trasferimento di gruppi alchilici a vari costituenti cellulari. Le alchilazioni del DNA ad opera di biscloroetilamine e nitrosuree, rappresentano probabilmente il principale meccanismo che porta a morte cellulare.

Gli antimetaboliti sono strutturalmente simili ai normali componenti cellulari, agiscono da antagonisti competitivi inibendo l’attività di enzimi essenziali per la replicazione cellulare. Il metatrexato, ad esempio, è un antagonista dell’acido folico che si lega al sito catalitico della diidrofolatoreduttasi interferendo con la sintesi della forma ridotta dell’acido folico e, di conseguenza, con la sintesi di DNA, RNA e proteine.

Gli antibiotici (dactinomicina, bleomicina e gli antraciclinici) si legano al DNA, intercalandosi tra le coppie di basi; in questo modo bloccano la sintesi di nuovo DNA o RNA, causando la scissione e la rottura dei filamenti di DNA ed interferendo con la duplicazione cellulare.

I tumori ematologici sono maggiormente sensibili al trattamento chemioterapico, mentre la maggior parte dei tumori solidi, come i tumori del polmone, della mammella, della prostata, dell’apparato digerente e delle ossa sono refrattari alla terapia.

La resistenza dei tumori ai chemioterapici si presenta come un fenomeno complesso e multifattoriale che coinvolge spesso diverse strutture e funzioni cellulari (Mattern et al, 2003). I meccanismi che portano la cellula verso la farmacoresistenza tendono a sovrapporsi e a seguire cinetiche differenti. La farmacoresistenza può essere sia intrinseca, se le cellule tumorali sono naturalmente resistenti al farmaco, sia acquisita, se viene indotta in seguito al trattamento farmacologico. In questo caso si ha spesso il fenomeno della polifarmacoresistenza in quanto le cellule tumorali che hanno acquisito il fenotipo resistente si mostrano refrattarie anche nei confronti di farmaci strutturalmente e funzionalmente diversi da quello che lo ha indotto.

1.1 Polifarmacoresistenza (Multidrug Resistance, MDR)

Questo meccanismo è stato definito da Broxtermann nel 1995 (Broxtermann et al, 1995) come resistenza cellulare a differenti agenti antitumorali. La resistenza farmacologica è dovuta ad una diminuita concentrazione intracellulare dei farmaci che non possono quindi raggiungere il loro sito d’azione citotossica. Tale diminuzione può essere dovuta: 1) ad una variazione del metabolismo; 2) ad un maggior efflusso o ad un diminuito accumulo del farmaco.

In questo secondo caso, il fenomeno dell’MDR è generalmente dovuto alla sovra-espressione di proteine di membrana appartenenti alla superfamiglia degli ABC trasportatori (ATP-binding cassette), in grado di rimuovere in presenza di ATP, una grande varietà di agenti citotossici (Hyde et al, 1990). Recentemente le proteine appartenenti a questa superfamiglia sono state classificate dall’Organizzazione Genoma Umano in 7 sottofamiglie, da A a G, in base a differenti caratteristiche quali struttura del gene e ordine e omologia di sequenza dei domini (Dean et al, 2001). Questi trasportatori sono solitamente presenti a bassi livelli in diversi tessuti, specialmente negli epiteli degli organi escretori, dove proteggono le cellule da sostanze potenzialmente tossiche e prevengono l’assorbimento di xenobiotici assunti con l’alimentazione, contribuendo in tal modo al conferimento della resistenza intrinseca (Li et al, 1994). I trasportatori attivi attualmente conosciuti per svolgere un ruolo importante nel fenomeno della MDR sono:

• i membri della sottofamiglia P-glicoproteina/TAP (ABCB);

• i membri della sottofamiglia delle proteine associate alla polifarmacoresistenza (ABCC);

• i membri della sottofamiglia MXR/BCRP (ABCG);

• la “lung resistance related protein” (LRP).

1.2 Molecole di trasporto

La maggior parte delle proteine di trasporto sono pompe d’efflusso appartenenti alla superfamiglia di proteine transmembrana ATP-dipendenti, detta ATPbinding cassette (ABC). Attualmente sono note più di 50 proteine appartenenti a questa famiglia. Di questa famiglia fanno parte la P-glicoproteina (P-gp), le multidrug resistance associated proteins (MRP) e la breast cancer resistance associated protein (BCRP) chiamata anche mitoxantrone resistance protein (MXR) (Pornngarm Limtrakul et al, 2007). Queste proteine sfruttano l’energia fornita dall’idrolisi dell’ATP per trasportare ed espellere all’esterno della cellula, attraverso vari tipi di membrane cellulari, una grande varietà di molecole, da piccole molecole come cationi organici, aminoacidi, antibiotici, a macromolecole come proteine e polisaccaridi.

1.3 La P-glicoproteina

La P-gp ha destato molto interesse per il ruolo rivestito nella farmacoresistenza tumorale. La P-gp è la pompa d’efflusso più studiata, fu descritta da Juliano e Ling nel 1976, mentre il gene mdr-1 fu isolato nel 1986 da una linea cellulare (KB-C2.5) di carcinoma umano con fenotipo MDR, in cui la resistenza era stata indotta mediante trattamento con colchicina (Chen et al, 1986; Ueda et al, 1987). Questo gene codifica per la P-gp (Ueda et al, 1986), una proteina di membrana di 1286 aminoacidi, con peso molecolare di 170 kDa (Ueda et al, 1999; Ambudkar et al, 2003).

La P-gp è costituita da due metà omologhe ciascuna delle quali contiene sei domini transmembrana (TM), altamente idrofobici che attraversano la membrana con segmenti ad α-elica, e un dominio di legame per i nucleotidi (NBD) che ha una notevole omologia con potenziali siti di legame nucleotidico, presenti sui componenti periferici di trasportatori attivi della membrana di alcuni batteri (Chen et al, 1986). Le due metà omologhe sono separate da una regione di legame flessibile (Fig. 1) (Ueda, 1999 et al; Ambudkar, 2003). La Pglicoproteina rappresenta il primo membro della famiglia dei trasportatori ABC scoperto negli eucarioti. I singoli domini sono rappresentati da polipeptidi separati nei procarioti e da un’unica proteina di fusione negli eucarioti.

Figura 1. Organizzazione dei domini della P-glicoproteina e localizzazione dei residui aminoacidici che alterano la specificità di substrato con una singola mutazione. Modificata da Ueda et al. (1987).

È stato dimostrato che la delezione di una sequenza aminoacidica centrale della regione linker della P-gp, comporta la formazione di una proteina la cui espressione sulla superficie cellulare è simile a quella non mutata, mentre la funzionalità risulta essere alterata. Le proprietà funzionali della P-gp possono essere ripristinate inserendo, nella regione della delezione, un peptide con struttura secondaria flessibile (Hrycyna et al, 2001). Questi dati hanno dimostrato che l’interazione tra le due metà della P-gp è essenziale per il corretto funzionamento della pompa e che la regione linker flessibile coordina le due metà, facendo avvenire la corretta cooperazione tra i due siti di legame dell’ATP. Tenendo conto di questo, è stato proposto che la struttura della proteina sia toroidale, con le due metà affacciate a costituire un canale a simmetria bilaterale, e tenute unite da legami crociati tra l’elica 6 e la 12 (Fig. 2).

Figura 2. Domini ad α-elica che costituiscono il poro transmembrana della P-glicoproteina. Modificato da Higgins et al. (1992).

Sono stati proposti diversi modelli per spiegare il meccanismo mediante il quale la P-gp trasporta il farmaco fuori dalla cellula. Uno dei più accreditati prevede che, durante il ciclo d’estrusione del chemioterapico, sia essenziale il legame e l’idrolisi dell’ATP (Fig. 3). Analisi mutazionali e modificazioni chimiche hanno stabilito che l’ATP si leghi a ciascun dominio di legame dei nucleotidi (NBD) e che successivamente venga idrolizzato (Uurbatsch et al, 1995a; Uurbatsch et al, 1995b; Hrycyna et al, 1998). I due processi d’idrolisi avvengono durante un singolo ciclo catalitico: uno è associato con l’efflusso del farmaco, mentre l’altro induce un cambiamento conformazionale che prepara la P-gp per un nuovo ciclo (Sauna and Ambudkar, 2001).

Ogni ciclo catalitico è costituito dalle seguenti tappe (Fig. 3):

• FASE I: il farmaco e l’ATP si legano alla P-gp

• FASE II: idrolisi di una molecola di ATP seguita da un cambiamento conformazionale della pompa che ne riduce l’affinità per il substrato e per l’ADP

• FASE III: rilascio dell’ADP seguito da un altro cambiamento conformazionale

• FASE IV: legame del nucleotide; quello del substrato continua ad essere ridotto

• FASE V: idrolisi di una nuova molecola di ATP

• FASE VI e VII: rilascio di Pi e ADP. Si completa con queste due fasi il ciclo catalitico, riportando la molecola della P-gp nella fase iniziale in grado di legare nuovamente il substrato e l’ATP.

Figura 3. Schema proposto per il ciclo catalitico della P-gp. Le ellissi rappresentano il sito di legame per il substrato, sito ON e sito OFF; l’esagono il sito con ridotta affinità per il substrato; i due cerchi sovrapposti i siti di legame per l’ATP (la sovrapposizione indica che entrambe i siti sono richiesti per l’idrolisi); i quadrati vuoti con i margini tondi rappresentano i siti con ridotta affinità per l’ATP. Modificato da Sauna et al. (2001).

Modificazioni post-traduzionali, come glicosilazione e fosforilazione, possono, inoltre, modificare sia l’espressione che la funzionalità della P-glicoproteina. La glicosilazione sembra non essere essenziale per il suo corretto funzionamento, ma può essere importante per una sua traslocazione in membrana. La fosforilazione sembrerebbe correlata con la capacità di trasporto della P-gp. La breve esposizione ad esteri del forbolo, attivatori delle protein-chinasi, può aumentare la quantità di proteina fosforilata inducendo una riduzione della concentrazione intracellulare del farmaco e un aumento della resistenza. Il trattamento con inibitori delle chinasi produce l’effetto opposto. Non è ancora noto se ci sia un rapporto diretto tra sensibilità al chemioterapico e grado di fosforilazione della P-gp (Glavy et al, 1997). È stato visto che linee cellulari selezionate con alte concentrazioni di chemioterapico spesso mostrano amplificazione genica di mdr1, mentre linee cellulari con più basso grado di resistenza non mostrano amplificazione, suggerendo che l’aumentata espressione si ottenga per attivazione trascrizionale (Zhao et al, 1994).

Le principali associazioni tra l’espressione della P-gp e la farmacoresistenza sono state studiate nella leucemia mieloide acuta, nel carcinoma del polmone e nell’osteosarcoma (Gottesman et al, 2002). Nelle cellule tumorali, dove svolge il ruolo di pompa di efflusso del farmaco, la P-gp è prevalentemente localizzata nella membrana plasmatica. Tuttavia diversi altri compartimenti cellulari possono essere potenziali siti della P-gp. E’ stata, inoltre, trovata nelle vescicole intracitoplasmatiche e nell’apparato del Golgi dove ha un ruolo nel trasportare il farmaco dal nucleo verso la periferia cellulare; nella membrana nucleare e all’interno del nucleo dove è coinvolta nella rimozione del farmaco dal bersaglio intranucleare ovvero dal DNA (Molinari et al, 2002). Sebbene dapprima sia stata

identificata come una proteina coinvolta nella polifarmacoresistenza, oggi è noto che la P-gp è espressa anche nei tessuti normali dove svolge funzione di protezione e detossificazione. Nella barriera ematoencefalica è localizzata sulla superficie luminale delle cellule endoteliali dei capillari, con lo scopo di prevenire l’ingresso di tossine e xenobotici. È inoltre localizzata nella membrana apicale degli epatociti dove trasporta tossine nella bile ed è espressa sulle cellule epiteliali del sistema gastro-intestinale ed urinario dove svolge il ruolo di rimozione del farmaco. Sulla superficie apicale del sinciziotrofoblasto protegge il feto da xenobiotici tossici. Infine è espressa nelle cellule immunocompetenti, quali cellule natural killer, macrofagi e linfociti T e B, cellule dendritiche presentanti l’antigene (Johstone et al, 2000). Dal punto di vista clinico, la P-gp può giocare un ruolo importante nella terapia anti-AIDS e antitumorale, essendo in grado di conferire resistenza tramite il riconoscimento, il legame e l’espulsione dall’interno delle cellule di un’ampia varietà di sostanze idrofobiche e anfipatiche, tra i quali diversi farmaci anticancro e di inibitori dell’HIV proteasi (Gutmann et al, 1999).

I substrati tradizionali della P-gp comprendono, tra gli agenti citotossici, agenti strutturalmente non correlati come le antracicline, gli alcaloidi della Vinca, i tassani, l’etoposide (Bradshaw et al, 1998; Borst et al, 2000). Le antracicline (es. doxorubicina, epirubicina e daunorubicina) sono alcuni tra gli agenti antitumorali più utilizzati nel trattamento dei tumori solidi e di quelli ematologici (Puglisi et al, 2007; Gonzalez-Angulo et al, 2007). La doxorubicina e la epirubicina sono attive nei carcinoma della mammella, dell’ovaio, della cervice uterina e dell’endometrio così come nei sarcomi e nei linfomi; la daunorubicina mostra invece attività nella leucemia linfoblastica acuta e in quella mieloblastica acuta.

Non sorprende quindi che l’aumentata espressione del gene mdr-1 in campioni tumorali di pazienti non chemiotrattati affetti da tumore intrinsecamente resistente ai suddetti farmaci, ed in campioni tumorali di pazienti che sono divenuti resistenti dopo trattamento chemioterapico, dimostri che la MDR mediata dalla P-gp gioca un ruolo clinico importante in molti tumori umani, ed è per questo che la sovraespressione di questa glicoproteina nelle cellule tumorali rappresenta un bersaglio terapeutico importante al fine del superamento della

resistenza (Kim et al, 1999).

1.4 Modulazione della MDR mediata dalla P-gp ed effetto chemiosensibilizzante

Da quanto detto finora si evince che uno dei principali obiettivi della ricerca oncologica è l’individuazione di sostanze con potenziale attività “chemiosensibilizzante”, cioè in grado di interferire con i meccanismi molecolari alla base del fenomeno della farmacoresistenza. La maggior parte di queste sostanze tende ad inibire l’attività delle molecole di trasporto e, quindi, favorendo l’accumulo intracellulare dell’agente chemioterapico e il raggiungimento del sito d’azione citotossica, aumentando la sensibilità delle cellule tumorali farmacoresistenti al trattamento (Krishna et al, 2000). Il chemiosensibilizzante ideale dovrebbe essere in grado di superare la farmacoresistenza, sia intrinseca sia indotta, e presentare scarsi o nessun effetto collaterale. Studi effettuati in vitro hanno permesso di suddividere in tre classi principali le sostanze con effetto modulatorio nei confronti della MDR.

I modulatori di prima generazione come ad esempio il verapamil, noto inibitore del canale L voltaggio-dipendente del Ca²+, efficace nel trattamento dell’angina pectoris, è in grado di inibire la P-gp attraverso un meccanismo non-competitivo, bloccando l’efflusso della doxorubicina (DOX) in cellule tumorali farmacoresistenti. Tuttavia, le concentrazioni di verapimil usate danno notevoli effetti citotossici, quali ipotensione e problemi cardiaci (Pereira et al, 1994).

Gli effetti tossici dose-limitanti di questa tipologia di farmaci modulatori ne hanno precluso il loro utilizzo, soprattutto in ambito clinico, ed hanno spinto gli studiosi verso la ricerca di nuovi modulatori con ridotta tossicità ed elevata efficacia.

Ciò ha portato a modulatori di seconda generazione, i quali sono stereoisomeri

dei modulatori di prima generazione, come ad esempio l’R-enantiomero del verapamil. Essi hanno un profilo farmacologico sicuramente migliore, ma possiedono delle caratteristiche che ne limitano l’uso in ambito clinico. Gli agenti citotossici e i modulatori di seconda generazione sono dei substrati degli isoenzimi del citocromo P-450 presente nel fegato. La competizione tra gli agenti citotossici e i modulatori di seconda generazione a livello di questo enzima può aumentare i livelli sierici del farmaco con conseguente effetto citotossico per l’organismo. Inoltre molti modulatori di seconda generazione sono substrati di altri trasportatori della famiglia degli ABC transporters, la cui inibizione interferisce con la normale capacità dei tessuti di proteggere l’organismo da agenti citotossici (Thomas and Coley, 2003).

Si sta tentando di risolvere il problema sperimentando modulatori di terza generazione in grado di agire a concentrazioni nanomolari e di colpire specifici meccanismi MDR. Nonostante questi agenti siano tollerati in combinazione con chemioterapici, quali la DOX, non è stato ancora chiarito se possono essere usati come chemiosensibilizzanti e se possono essere applicati in clinica (Shabbits et al, 2001). Proprio per l’impellente necessità di superare gli effetti dannosi causati da sostanze chimiche di sintesi, l’interesse dei ricercatori si è rivolto verso l’utilizzo di sostanze naturali ed estratti vegetali, che possono non presentare effetti collaterali ma aumentare l’efficacia del trattamento farmacologico.

1.5 Impiego di sostanze naturali quali agenti chemioterapici

E’ dall’antichità che l’utilizzo di sostanze naturali con proprietà terapeutiche ha caratterizzato le popolazioni e, per un lungo periodo, gli estratti vegetali hanno rappresentato la principale risorsa per la cura di malattie. Con la rivoluzione industriale e il successivo sviluppo della chimica organica è stata data maggior importanza a prodotti sintetici rispetto a prodotti naturali. Questo cambiamento è stato favorito sia da una maggiore facilità nell’apportare modificazioni strutturali ai composti, per ottenere farmaci potenzialmente più attivi e sicuri, sia dai notevoli interessi economici. In questo contesto si sono delineate diverse correnti di pensiero sul concetto di salute e cura delle malattie. Nelle società industrializzate dell’Occidente l’uso delle sostanze naturali come farmaci è stato considerato un atteggiamento tipico delle classi sociali non economicamente agiate o come una pratica con significato magico e religioso ma privo di valore terapeutico. Tuttavia, anche se considerassimo soltanto l’impatto della scoperta della penicillina sullo sviluppo e sull’esito di numerose patologie infettive sostenute dai batteri, l’importanza delle sostanze naturali nella cura delle malattie diventerebbe palesemente chiara. A causa dei limiti spesso presentati dalle terapie convenzionali e degli effetti collaterali associati ai farmaci sintetici, negli ultimi anni si è osservato un crescente interesse dei ricercatori verso le terapie alternative e verso l’impiego di sostanze naturali derivate dalle piante (Rates et al, 2001; Ichikawa et al, 2007).

La natura ha fornito diversi agenti efficaci contro il cancro, sia di origine microbica (quali la dactomicina, la bleomicina e la doxorubicina) sia di origine vegetale (come la vinblastina o il taxolo) (Mayur et al, 2006; Kim and Park, 2002).

La ricerca di nuove sostanze antineoplastiche di origine naturale è ancora di grande attualità ed interesse e numerose componenti del mondo scientifico stanno lavorando in tal senso. Nel 1960 l’Istituto Nazionale del Cancro

Statunitense (National Cancer Institute, NCI) ha avviato il programma di screening, su larga scala, su diversi estratti naturali. Durante questo studio è stata valutata l’attività citotossica di 35000 sostanze di origine vegetale nei confronti di linee cellulari leucemiche murine. Nel 1985 l’NCI ha iniziato un nuovo programma valutando gli effetti di alcuni estratti dalle piante, dagli animali e dai microrganismi, sia nei confronti di tumori solidi (tumore del polmone, del colon, della pelle, del rene, dell’ovaio, del cervello, del seno e della prostata) che delle leucemie (Mann et al, 2002). Tali programmi hanno portato all’individuazione di numerose sostanze con promettente o, in alcuni casi, comprovata attività antitumorale.

Ecco alcuni esempi:

• Resveratrolo. Si tratta di una sostanza naturale contenuta nei grappoli dell’uva (Polygonaceae) e in piccole concentrazioni nel vino rosso (1,5-3 mg/L). Alcuni studi riportano che tale sostanza è capace di indurre una riattivazione del gene p53, noto gene oncosoppressore, favorendo così l’induzione della morte apoptotica in cellule tumorali del pancreas (Zigang Dong, 2003).

• Camptotecina. È un potente alcaloide chinolinico estratto da un albero cinese, Camptotheca acuminata, intorno agli anni ‘60. Agisce inibendo l’azione dell’enzima topoisomerasi I. E’ un forte inibitore della crescita, in vitro, di cellule leucemiche; inoltre viene utilizzato nel trattamento del carcinoma del fegato, del tumore della testa e del collo (Mukherjee et al, 2001).

• Paclitaxel (conosciuto anche come taxolo). E’ stato identificato nel 1971 come costituente attivo di un estratto della corteccia del fusto di un tasso del Pacifico (Taxus brevifolia). Promuove la polimerizzazione della tubulina ed inibisce il disassemblaggio dei microtubuli una volta che essi si sono formati. Poiché arresta il ciclo cellulare in una fase maggiormente sensibile alle radiazioni ionizzanti, può agire come radiosensibilizzante. Inoltre mostra una maggiore attività citotossica nei confronti dei tumori solidi, in particolare quello dell’ovaio

e del seno (Jordan et al, 2002).

• Vinblastina (VBL) e vincristina, comunemente chiamati “Vinca alcaloidi”, sono stati estratti dal Catharenthus roseus intorno agli anni ‘50. Lo studio di questi alcaloidi è nato dall’uso delle medesime piante per la cura del diabete. La granulocitopenia periferica e la diminuzione dell’attività del midollo osseo, osservati nei ratti trattati, hanno indirizzato la ricerca verso la chemioterapia contro il cancro. I Vinca alcaloidi si legano alla tubulina impedendone la polimerizzazione in microtubuli, con l’effetto di arrestare la cellula in mitosi. Oggi queste due sostanze naturali sono usate in ambito clinico: la vinblastina è usata principalmente nel trattamento del linfoma di Hodgkin e delle cellule tumorali germinali, mentre la vincristina è utilizzata nel trattamento di leucemie linfoblastiche acute e del linfoma di Hodgkin e non (Duflos et al, 2002).

• Sulforafano. Si tratta di un elemento appartenente alla famiglia degli isotiocianati organici, contenuto in alcuni vegetali commestibili come ad esempio i broccoli. Utilizzando cellule del tumore umano della prostata, è stato dimostrato che il sulforafano inibisce il rilascio del citocromo c inducendo così il processo di morte autofagica (Herman-Antosiewicz et al, 2006).

L’interesse per le sostanze naturali non è dovuto soltanto al loro utilizzo come agenti chemioterapici, ma anche come chemio-sensibilizzanti di farmaci convenzionali. I meccanismi cellulari attraverso i quali si esplica questa attività, sono ancora oggi oggetto di studio, si ipotizza infatti che alcune sostanze naturali di origine vegetale possano agire in maniera sinergica con altre, anche di natura diversa, consentendo di superare l’ostacolo della farmacoresistenza agendo in particolare sulla P-gp (Gilbert and Alves, 2003).

Ecco alcuni esempi:

- Lo screening di 43 estratti di piante della Tanzania ha permesso di selezionare due derivati dalla Acacia nilotica e della Annickia kummeriae, che possono avere effetto inibitorio sull’efflusso del farmaco mediato dalla P-gp (Deferme et al, 2003).

- E’ stato inoltre dimostrato che la somministrazione contemporanea di estratti della frutta, come fragola, arancia, menta, albicocca, e di farmaci chemioterapici aumenta l’assorbimento del farmaco nelle cellule del carcinoma intestinale (Deferme et al, 2002).

- L’estratto di Ficus Citrifolia contiene principi flavonici in grado di inibire l’efflusso del farmaco mediato dalla P-gp presente su cellule leucemiche (Simon et al, 2001).

- Il terpene-4-olo, il componente principale del tea tree oil estratto da Melalenca alternifolia è in grado di inibire la crescita in vitro delle cellule di melanoma umano. Risulta essere più efficace su linee resistenti esprimenti livelli elevati di P-gp, consentendo di superare la resistenza mediante un processo di apoptosi caspasi-dipendente (Calcabrini et al, 2004).

- Gli alcaloidi a nucleo sterolico, come la ciclopamina, estratta da piante appartenenti alla famiglia delle Liliaceae e la tomatidina, estratta da Solanaceae, sono in grado di sensibilizzare le cellule di tumorali alla doxorubicina e alla vinblastina (Lavie et al, 2001).

- Un altro alcaloide vegetale, appartenente alla classe dei bisbenzilisochinolinici, ha la capacità di inibire l’attività della P-gp aumentando l’accumulo intracellulare dei chemioterapici doxorubicina e vincristina su cellule tumorali del seno (Fu et al, 2001).

- La pervilleine A, un nuovo alcaloide tropanico ottenuto dall’estratto dell’Esythroxylum pervillei, è in grado di modulare la resistenza di cellule tumorali della linea linfoblastoide sensibile KB-V1 e resistente CEM/VLB 100 alla vinblastina (Mi et al, 2001).

1.6 La Voacamina

La voacamina (VOA) è un alcaloide bisindolico (Fig. 4) che ha dimostrato una forte attività antimalarica; essa viene estratta dalla corteccia di una pianta denominata Peschiera fuchsiaefolia che cresce in Brasile. La VOA appartiene alla famiglia delle Euphorbiaceae, piante infestanti della foresta Amazzonica. Numerosi studi attualmente in corso stanno dimostrando che gli estratti della peschiera hanno attività antiplasmodio (Federici et al, 2000), antitumorale, antiAIDS e anti-microbica.

Appena scoperta essa ha mostrato una notevole attività cardiotonica, con minore tossicità rispetto ai farmaci a base di cardenolide, trovando largo impiego nel trattamento di patologie cardiache (La Barre et al, 1955). In seguito è stata dimostrata una generale tossicità (Kingston et al, 1978) e un’intensa attività antimicrobica nei confronti dei batteri Gram positivi e negativi (Van Beek et al, 1984). La VOA è stata analizzata in vitro sul Plasmodium falciparum (Federici et al, 2000) dimostrando un’attività antiparassitaria nei confronti sia del ceppo sensibile alla clorochina che di quello resistente. Tuttavia non aumentava l’attività della clorochina sui ceppi resistenti (Ramanitrahasimbola et al, 2001). È stato dimostrato, inoltre, che la VOA aumenta l’effetto citotossico della vinblastina sulle cellule tumorali di una linea linfoblastoide resistente ai farmaci (You et al, 1994). Da questo studio è emerso che la vinblastina è in grado di legarsi direttamente alla P-gp, mentre la VOA, e altri composti simili come la coronaridina e la conoduramina, modulano il fenotipo MDR attraverso altri meccanismi. Il fatto che la VOA possa aumentare l’effetto citotossico dei farmaci sulle cellule tumorali ma non sul Plasmodium falciparum dimostra che i meccanismi alla base della farmacoresistenza delle cellule tumorali di mammifero sono diversi da quelli dei ceppi di Plasmodium falciparum (Bray and Ward, 1998). Precedenti studi condotti presso il laboratorio in cui è stata eseguita questa tesi hanno dimostrato che la VOA è in grado di aumentare l’effetto citotossico della doxorubicina nei confronti di cellule farmaco resistenti di osteosarcoma umano (Meschini et al, 2003) e che tale aumento è dovuto alla sua capacità di inibire, in maniera competitiva, la funzionalità della P-gp

aumentando quindi l’accumulo intracellulare dell’agente chemioterapico (Meschini et al, 2005).

Figura 4. Struttura chimica della voacamina

1.7 Tipi di morte cellulare

L’obbiettivo della chemioterapia è quello di favorire, solo ed esclusivamente, la morte delle cellule tumorali senza provocare altri danni collaterali. In biologia esistono almeno tre tipologie di meccanismi di morte cellulare (apoptosi, necrosi e autofagia), ragion per cui, qui di seguito ne verranno accennate le principali caratteristiche. La conoscenza dei numerosi pathway di morte cellulare può favorire il perfezionamento di molecole target per migliorare l’attività biologica di sostanze antitumorali.

1.7.1 Apoptosi

In biologia, il termine apoptosi fu coniato nel 1972 da John F. Kerr (Kerr et al, 2002), a partire dal termine greco che indica la caduta delle foglie e dei petali dei fiori, per indicare una forma di morte cellulare programmata. Si tratta di un processo ben distinto rispetto alla necrosi cellulare, e in condizioni normali contribuisce al mantenimento del numero di cellule di un sistema. Al contrario della necrosi, che è una forma di morte cellulare risultante da un acuto stress o trauma cellulare, l’apoptosi è portata avanti in modo ordinato e regolato, richiede consumo di energia (ATP) e generalmente porta ad un vantaggio durante il ciclo vitale dell’organismo (è infatti chiamata da alcuni morte altruista o morte pulita). Durante il suo sviluppo, ad esempio, l’embrione umano presenta gli abbozzi di mani e piedi “palmati”: affinché le dita si differenzino, è necessario che le cellule che costituiscono le membrane interdigitali muoiano. Dagli inizi degli anni ‘90 la ricerca sull’apoptosi ha visto una crescita spettacolare. Oltre alla sua importanza come fenomeno biologico, ha acquisito un enorme valore medico; infatti, processi difettosi di apoptosi possono indurre numerose patologie. Una eccessiva attività apoptotica può causare disordini da perdita di cellule (si vedano ad esempio alcune malattie neurodegenerative, come il morbo di Parkinson), mentre una apoptosi carente può implicare una crescita cellulare incontrollata, meccanismo alla base delle neoplasie. L’apoptosi può avvenire quando una cellula è danneggiata oltre le proprie capacità di riparazione, oppure infettata da un virus. Il segnale apoptotico può venire dalla cellula stessa, dal tessuto circostante o da cellule del sistema immunitario. La proteina oncosoppressore p53 svolge la sua funzione legando il DNA. Se la capacità apoptotica di una cellula è danneggiata (ad esempio a causa di una mutazione), oppure se è stata infettata da un virus in grado di bloccare efficacemente l’inizio della cascata apoptotica, la cellula danneggiata continuerà a dividersi senza limiti, trasformandosi in un cancro. Per esempio, il papillomavirus umano (HPV), esprime due oncogeni: E6 stimola la degradazione della proteina p53, che è una chiave fondamentale della linea apoptotica, attraverso un sistema proteolitico mediato da ubiquitina ed E7 si lega a Rb (gene soppressore tumorale) inibendola. In questo modo si ha lo sviluppo del carcinoma cervicale. Condizioni di stress, quali la mancanza di nutrienti, oppure il danneggiamento del DNA dovuto a molecole tossiche (es: idrocarburi policiclici) o

all’esposizione ai raggi ultravioletti (UV) o radiazioni ionizzanti (raggi gamma e raggi X) ma anche condizioni di ipossia, possono indurre una cellula ad iniziare l’apoptosi.

In un organismo adulto, il numero delle cellule contenute in un organo deve rimanere costante entro un certo margine. Le cellule del sangue e degli epiteli di rivestimento, ad esempio, sono costantemente rinnovate a partire dai loro progenitori staminali; ma la proliferazione è compensata da una costante morte cellulare. In un organismo umano adulto attorno ai 50-70 miliardi di cellule muoiono ogni giorno a causa dei processi apoptotici. In un anno la massa delle cellule ricambiate è pari al peso del corpo stesso. L’omeostasi è mantenuta quando la consistenza delle mitosi (proliferazione cellulare) in un tessuto è bilanciata dalla morte di un numero equivalente di cellule. Se questo equilibrio è disturbato si hanno due scenari:

• Se le cellule si dividono più velocemente di quanto muoiano, si sviluppa un tumore.

• Se le cellule muoiono più velocemente di quanto si dividano, si hanno disordini da perdita di cellule.

1.7.1.1 Segni morfologici

Una cellula in apoptosi mostra evidenti caratteristiche morfologiche meglio individuabili mediante sistemi di microscopia ottica ed elettronica.

1. La cellula diventa sferica e perde contatto con le cellule adiacenti. Questo avviene perché le proteine del citoscheletro sono digerite da specifiche peptidasi (chiamate caspasi) che sono state attivate all’interno del citoplasma.

2. La cromatina comincia ad essere degradata e condensata (il nucleo al microscopio risulta eterocromatico).

3. La cromatina continua il processo di degradazione (in tipici frammenti lunghi 200 paia di basi circa) e condensazione in corpi addossati al nucleolemma. A questo punto la doppia membrana che delimita il nucleo appare ancora completa; tuttavia, come osservarono Kihlmark e colleghi (Kihlmark et al, 2004), le caspasi specializzate sono già ad uno stadio avanzato di degradazione delle proteine dei pori nucleari ed hanno iniziato la degradazione delle lamine, le proteine che “foderano” l’interno della membrana nucleare. Va notato che, mentre il primo stadio di condensazione della cromatina è stato osservato in cellule non apoptotiche, questo stadio avanzato (chiamato picnotico) è considerato preludio dell’apoptosi.

4. Il nucleolemma diventa discontinuo e le molecole di DNA sono frammentate (il processo è definito carioressi. Il nucleo si rompe in alcuni “corpi cromatinici” o “unità nucleosomiali”.

5. La membrana plasmatici si frammenta.

6. La cellula si divide in più parti, chiamate corpi apoptotici, grazie ad un processo che prende il nome di blebbing, che sono in seguito fagocitati.

1.7.1.2 Marcatori biochimici dell’apoptosi

La cellula morente che si avvia all’ultimo stadio dell’apoptosi, espone sulla membrana plasmatica dei segnali eat me (letteralmente, mangiami), come la fosfatidilserina. Normalmente la fosfatidilserina, fosfogliceride che si trova nello strato citosolico della membrana plasmatica, durante l’apoptosi è ridistribuita anche sulla faccia extracelluare da un’ipotetica (non ancora isolata) proteina detta scramblase (traducibile dall’inglese come l’enzima che mette in disordine). Fagociti necrofagi, come i macrofagi, hanno recettori specifici per la fosfatidilserina. La rimozione delle cellule morte è necessaria per prevenire la risposta infiammatoria (Savill et al, 2003). I messaggi pro-apoptotici provenienti dall’esterno della cellula (induttori estrinseci) saranno trattati nella sezione successiva. I segnali pro-apoptotici provenienti dall’interno della cellula (induttori intrinseci) costituiscono una risposta allo stress, come la mancanza di nutrienti o un danno esteso al DNA. Sia la via estrinseca che quella intrinseca hanno in comune l’attivazione degli effettori centrali dell’apoptosi, un gruppo di proteasi (specifiche per delle cisteine) chiamate caspasi, che dirigono la distruzione degli elementi strutturali (citoscheletro) e funzionali (organuli) della cellula.

Le caspasi sono normalmente soppresse dalla proteina IAP (inibitrice dell’apoptosi) (Fesik and Shi, 2001). Quando una cellula riceve uno stimolo apoptotico, IAP è silenziata da SMAC (Secondo Attivatore Mitocondriale delle Caspasi) una proteina mitocondriale, che è rilasciata nel citosol. SMAC lega IAP, e legandosi “inibisce l’inibitore” che evitava di far iniziare la cascata apoptotica. Prima di descrivere il rilascio di SMAC è però necessario osservare con attenzione due processi estrinseci molto studiati: le vie del TNF e del Fas. Il Fattore di Necrosi Tumorale (TNF o Tumor Necrosis Factor), una proteina di 157 amminoacidi con funzione di segnale intercellulare appartenente alla classe delle citochine, è prodotta principalmente dai macrofagi ed è il principale mediatore estrinseco dell’apoptosi. La membrana cellulare ha due recettori specializzati per TNF: TNF-R1 e TNF-R2. Il legame del TNF al TNF-R1 è considerato l’innesco della via che attiva le caspasi. Fas (Apo-1 o CD95) è un

altro recettore dei segnali apoptotici estrinseci ed appartiene alla superfamiglia dei recettori TNF (Wajant et al, 2003). Il ligando di Fas (FasL o Fas Ligand) è una proteina transmembrana ed è parte della famiglia dei TNF. L’interazione ligando-recettore si risolve nella formazione di un complesso di segnalazione che induce la morte cellulare (DISC, death-inducing signaling complex), che contiene la Fas-associated protein with death domains (abbreviata come FADD e recante domini, detti di morte, fondamentali per la cascata pro-apoptotica) e le caspasi 8 e 10. In alcuni tipi di cellule (tipo I), le caspasi-8 attive attivano direttamente numerose altre caspasi che portano all’apoptosi; in altri tipi di cellule (tipo II), Fas-DISC inizia un processo a feed-back che aumenta il rilascio di fattori pro-apoptosi dai mitocondri e amplificano l’attivazione delle caspasi-8. A valle dell’attivazione di TNF-R1 e Fas – almeno nelle cellule dei mammiferi – il bilanciamento tra i membri pro-apoptotici (come BAX, BID, o BAD) e antiapoptotici (Bcl-Xl e Bcl-2) della famiglia Bcl-2 viene compromesso. Tale equilibrio è regolato dalla formazione di omodimeri nella membrana esterna del mitocondrio. La formazione di omodimeri (di BAK o BAX) è necessaria per rendere permeabile la membrana mitocondriale esterna e rilasciare, così, l’attivatore delle caspasi. Non è ancora chiaro come BAK e BAX siano controllate dalla cellula non apoptotica; è stato ipotizzato che una proteina di membrana mitocondriale, VDAC2, interagisca con BAK inibendola. Quando è ricevuto un segnale, prodotti della cascata di attivazione – come tBID, BIM o BAD – rimpiazzano VDAC2, così che BAK e BAX possano attivarsi e la membrana mitocondriale diventi permeabile; si è notato che queste proteine della famiglia delle Bcl-2 hanno domini formanti pori (che appunto rendono permeabile la membrana), che favoriscono il aggio di molecole proapoptotiche come il citocromo c (Murphy et al, 2000). Anche altre molecole sono rilasciate dai mitocondri, come SMAC o AIF. Una volta che è stato rilasciato il citocromo c, esso si lega ad Apaf-1 e ad ATP; in seguito si unisce ad una proteina pro-caspasi-9, creando un complesso multiproteico chiamato apoptosoma. L’apoptosoma stacca questa pro-caspasi, rendendo attiva la caspasi9, la quale a sua volta attiva l’effettore caspasi-3.

Fig. 5. Rappresentazione schematica dei principali step molecolari coinvolti durante l’apoptosi.

L’intero processo richiede energia e un’organizzazione cellulare non troppo danneggiata. Infatti se una cellula è danneggiata oltre un certo limite, non ha abbastanza “tempo” e “forze” di portare avanti il processo dell’apoptosi, ma va in necrosi. Va osservato, infine, che le vie apoptotiche riassunte prima sono soggette a complessi meccanismi regolatori (quello che è chiamato Cellular Signaling Network) e non c’è una relazione biunivoca tra la ricezione dei segnali TNF o FasL con un’esecuzione completa della via apoptotica. Fas, ad esempio, è anche implicata – paradossalmente – nella proliferazione cellulare, attraverso vie non ancora scoperte; l’attivazione sia di Fas che di TNF-R1 portano anche all’attivazione di (NF-κB) (Fattore Nucleare kappa-B), che induce l’espressione di alcuni geni che giocano importanti ruoli in diversi processi biologici, inclusi proliferazione cellulare, morte cellulare, sviluppo cellulare e risposta immunitaria. Il legame tra TNF e apoptosi dimostra il perché una produzione anormale di TNF giochi un ruolo fondamentale in varie malattie umane, specialmente (ma non solo) in quelle autoimmuni, come il diabete e la sclerosi multipla.

In un articolo del 2003, Takaoka e colleghi (Takaoka et al, 2003) hanno descritto come gli interferoni-alfa e -beta (IFN-alfa/beta) inducano la trascrizione del gene p53, risultante in un incremento del livello di proteina p53 e l’inizio dell’apoptosi nelle cellule tumorali (Takaoka et al, 2003). La proteina p53, infatti, è un soppressore tumorale, e va considerato come un fattore anti-crescita e anti-oncogenico. Tale lavoro ha contribuito a chiarire il ruolo giocato dall’interferone nel guarire alcune forme umane di cancro e ha stabilito il legame tre p53 e interferoni. La risposta della p53, non solo contribuisce alla soppressione tumorale, ma è importante nel sostenere la risposta apoptotica anche nelle infezioni virali.

1.7.2 Necrosi

La necrosi (in Greco=morto) è il nome dato alla morte non programmata di cellule e tessuti viventi. La necrosi è caratterizzata da alcuni cambiamenti cellulari irreversibili nel nucleo (cariolisi, picnosi e carioressi) e nel citoplasma (intensa eosinofilia, perdite strutturali, ecc.). Questo scenario microscopico è molto simile a quello dell’apoptosi; infatti, in un lavoro di Majno e Joris del 1995 (Majno and Joris, 1995) vennero caratterizzate cellule morte che presentavano segni tipici dell’apoptosi (necrosi apoptotica) e gruppi di cellule morte per ischemia (necrosi ischemica). La morte cellulare ischemica è caratterizzata da rigonfiamento. Il termine usato in letteratura per descrivere questa tipologia di morte è “oncosis”. Praticamente il rigonfiamento rappresenta una prima fase del pathway necrotico; tale fase presenta le seguenti caratteristiche: 1) rigonfiamento cellulare di vari organuli, formazione di bolle e aumento della permeabilità di membrana; 2) non funzionalità delle pompe di membrana; 3) danno ischemico e/o da agenti tossici che interferiscono con i meccanismi di sintesi dell’ATP o con l’aumento della permeabilità della membrana plasmatica; 4) evoluzione entro 24 ore dalla successiva necrosi; 5) è solitamente accompagnata da cariolisi. Il rigonfiamento che precede la necrosi può essere evidenziato con test di permeabilità su cellule intere o attraverso la microscopia elettronica.

Fig. 6. Illustrazione dell’apoptosi e del rigonfiamento secondo Majno e Joris (1995).

1.7.3 Autofagia

Il significato dell’autofagia è da ricercarsi nella possibilità che vari organuli citoplasmatici possano subire un ricambio (turn-over), per garantire il rinnovarsi continuo di parti citoplasmatiche danneggiate o per consentire l’eliminazione di detriti di origine metabolica. Affinché la degradazione degli organuli da riciclare possa avvenire in un comparto acido che di fatto sia separato dal resto del citoplasma, è necessario che la cellula generi alcuni sistemi di membrana a partire dalle cisterne del reticolo endoplasmatico o dalle cisterne dell’apparato di Golgi. Il meccanismo consiste nella formazione di una doppia membrana intorno all’organulo danneggiato (es. il mitocondrio), formando così una struttura a forma di sacco, conosciuta meglio come fagoforo. La chiusura di tale membrana porta alla formazione di una vescicola con una doppia-membrana, chiamata autofagosoma (Seglen and Bohley, 1992), successivamente fa seguito il movimento e l’unione della vescicola con i lisosomi, che contengono enzimi litici. La membrana esterna dell’autofagosoma si fonde con il lisosoma, formando un vacuolo acidificato, l’autolisosoma (Eskelinen et al, 2005; Kondo et al, 2005; Kroemer et al, 2005). Un marcato aumento dell’autofagia si osserva in alcune condizioni sperimentali tra cui la mancanza di nutrienti e/o di fattori di crescita o in risposta a varie condizioni di stress, l’esposizione alle radiazioni ionizzanti, sostanze citotossiche e ipossia. (Dunn et al, 1994; Klionsky and Emr, 2000; Wang and Klionsky, 2003; Meijer and Codogno, 2004). Una volta che tale processo digestivo è stato completato, i vacuoli daranno origine ai corpi residui che saranno eliminati dalla cellula per esocitosi oppure rimarranno nel citoplasma formando così i granuli di lipofuscina. Questi granuli si accumulano soprattutto in seguito all’invecchiamento della cellula.

Fig. 7. Rappresentazione schematica delle fasi principali del pathway autofagico.

L’autofagia in primo luogo, rappresenta quindi un processo catabolico che garantisce il mantenimento omeostatico delle cellule attraverso l’eliminazione di proteine alterate e di organelli danneggiati. Il meccanismo molecolare alla base dell’autofagia è stato caratterizzato inizialmente in cellule di lievito di Saccharomyces cerevisiae (Levine and Klionsky, 2004; Ohsumi et al, 2001). Questi studi indicano una serie di proteine coinvolte nel processo degradativo autofagico, codificate dai geni Atg, alcuni dei quali sono evolutivamente ben conservati (Klionsky et al, 2003; Harding et al, 1995). Nelle prime fasi dell’autofagia sono coinvolti due sistemi coniugati, Atg12 e Atg8 (Ohsumi et al, 2001). La proteina Atg12p viene coniugata alla proteina Atg5p tramite la proteina Atg7p insieme con l’enzima like-E1, e tramite la proteina Atg10p con l’enzima like-E2. Il coniugato risultante Atg5/12p forma un complesso con Atg16 e si associa con la membrana autofagica, infine si stacca in seguito al completamento della formazione dell’autofagosoma (Mizushima et al, 2003). La proteina Atg8p è la prima ad essere tagliata con Atg4p, una proteasi cisteinica specifica, in modo tale da favorire l’esposizione di un residuo di glicina (Kirisako et al, 2000). Atg8p è quindi attivata da Atg7p, la stessa proteina likeE1 che attiva Atg12p e da Atg3p, una proteina like-E2 specifica per Atg8p (Kirisako et al, 2000). Infine, la glicina presente sull’estremità C-terminale dell’Atg8p viene coniugata attraverso un legame ammidico con il gruppo amminico del lipide fosfatidiletinolamina (Ichimura et al, 2000). La proteina del lievito Atg8p è altamente omologa a diverse proteine di mammifero, inclusa MAP1-LC3 (LC3), GATE-16 e GABARAP (Mann and Hammarback, 1994). La modificazione di LC3 sull’estremità C-terminale, come per Atg8p, è una fase essenziale per la formazione degli autofagosomi (Mizushima et al, 2001). È stato recentemente scoperto che la proteasi Atg4B di mammifero è coinvolta nel taglio di LC3, tramite l’esposizione della glicina 120 sull’estremità C-terminale (Kabeya et al, 2004). Questa forma di LC3, denominata LC3-I (forma citoplasmatica), viene in seguito modificata in una forma legata alla membrana, LC3-II, tramite le proteine Atg7p e Atg3p (Tanida et al, 2002; Tanida et al, 2001). Sebbene siano implicate in differenti pathway di traffico di membrana intracellulare, tutte e tre le proteine di mammifero (LC3; GATE-16 e

GABARAP) omologhe di Atg8p sono processate tramite le proteasi like-Atg4p e tramite i sistemi di coniugazione like-Atg7p e like-Atg3p per generare la forma legata alla membrana (Kabeya et al, 2004; Tanida et al, 2003). È stato dimostrato che LC3 viene incorporato specificamente nelle vescicole autofagiche in condizioni che inducono autofagia, in questo modo la proteina può essere utilizzata come marker degli autofagosomi in cellule di mammifero (Mizushima et al, 2004; Bampton et al, 2005).

L’autofagia rappresenta anche un meccanismo di difesa che permette alle cellule di sopravvivere in condizioni ambientali o di crescita avverse. Alcuni recenti studi hanno dimostrato però che in diversi modelli cellulari tumorali l’induzione del processo autofagico può portare alla morte cellulare (Kondo et al, 2005; Jin et al, 2007). Ulteriori ricerche invece hanno dimostrato che l’autofagia può avere un effetto protettivo verso alcune terapie citotossiche, bloccando il pathway apoptotico delle cellule tumorali; mentre per altre tipologie di cellule tumorali il pathway di morte autofagica viene innescato in risposta alla chemioterapia. (Codogno and Meijer, 2005; Gonzales-Polo et al, 2005). Il ruolo che l’autofagia ha nella progressione tumorale e nelle terapie antitumorali non è stato ancora del tutto chiarito. Tuttavia, la possibilità che si possa migliorare la risposta farmacologica dei tumori, mediante strategie terapeutiche basate sull’uso di sostanze capaci di indurre autofagia e, possibilmente, senza effetti collaterali indesiderati, sta suscitando un grande interesse da parte degli oncologi (Kondo and Kondo, 2006; Ricci and Zong, 2006).

Studi precedenti (Meschini et al, 2003), hanno dimostrato che la voacamina (VOA) esercita un effetto chemiosensibilizzante su cellule tumorali farmacoresistenti (MDR) di osteosarcoma umano trattate con DOX. Inoltre la VOA è capace di inibire competitivamente la P-gp (Meschini et al, 2005); ciò spiega l’aumento del contenuto intracellulare di DOX e l’aumento dell’effetto citotossico sulle cellule MDR. Successivamente, studi preliminari condotti dallo stesso gruppo di ricerca hanno indicato che la VOA aumenta la citotossicità della DOX favorendo la morte cellulare per autofagia anziché per apoptosi (Meschini et al, 2007).

2. SCOPO DEL LAVORO

Questa tesi sperimentale è stata svolta presso il reparto Metodi Ultrastrutturali per Terapie Innovative Antitumorali del Dipartimento di Tecnologie e Salute dell’Istituto Superiore di Sanità, nell’ambito di un progetto di ricerca che si propone di chiarire i meccanismi subcellulari e molecolari alla base del fenomeno della farmacoresistenza, sia intrinseca che acquisita, delle cellule neoplastiche ad agenti antitumorali. In particolare il reparto è impegnato nell’individuazione di nuove sostanze naturali in grado di inibire i meccanismi di farmacoresistenza e, quindi, con promettente attività chemiosensibilizzante. Lo scopo di questo studio è stato quello di analizzare il meccanismo responsabile dell’effetto citotossico rivelato in linee cellulari di osteosarcoma umano sensibili (U2/OS-WT) e resistenti (U2/OS-DX) dopo trattamento con voacamina (VOA), sostanza naturale di origine vegetale estratta dalla Peschiera fuchsiaefolia. In particolare si è voluto capire quale sia il meccanismo di morte cellulare (apoptosi o autofagia) coinvolto nell’aumentata citotossicità osservata dopo il trattamento combinato voacamina-doxorubicina (VOA/DOX) nelle linee cellulari utilizzate. Il raggiungimento di questo scopo è stato ottenuto mediante un’analisi morfologica ultrastrutturale (microscopia ottica ed elettronica) e una valutazione quantitativa e qualitativa dei diversi parametri coinvolti nei meccanismi molecolari della morte cellulare (tecniche di biologia cellulare e molecolare).

3. MATERIALI E METODI

3.1 La Voacamina

La sostanza viene estratta dalla corteccia della radice di una pianta infestante, originaria dell’Amazzonia, la Peschiera fuchsiaefolia. La corteccia della radice è stata fornita da Mr. S. Rossi from CIBECOL Ltda (Porto Alegre, Brazil) alla Dott.ssa E. Federici del Dipartimento del Farmaco dell’Istituto Superiore di Sanità, la quale si è occupata dell’estrazione e della purificazione della VOA. E’ stata aggiunta una soluzione di acido acetico al 2% all’estratto vegetale. Successivamente è stato utilizzato il diclorometano per estrarre gli alcaloidi terziari, i quali sono stati sottoposti a distribuzione in controcorrente tra diclorometano e un tampone citrato di piombo a pH decrescente da 6.0 a 2.2. La VOA è stata così isolata e identificata tramite spettroscopia di massa e risonanza magnetica nucleare ¹H e ¹³C (Federici et al, 2000). L’estratto di VOA è stato disciolto e reso solubile in DMSO (Panreacquimicasa, Barcelona, Spain) fino ad ottenere la concentrazione di 100 μg/ml, infine ulteriormente diluito con terreno di coltura IMDM (Iscove’s modified Dulbecco’s medium) per ottenere le concentrazioni necessarie per i nostri esperimenti. La VOA è stata utilizzata alla concentrazione di: 1 μg/ml; 2.5 μg/ml; 5 μg/ml e 10 μg/ml.

3.2 Colture Cellulari

La linea cellulare di osteosarcoma sensibile (U2/OS-WT) e la controparte resistente MDR (U2/OS-DX), utilizzate per questo lavoro, sono state fornite gentilmente dalla Prof.ssa Scotlandi K. degli “Istituti Ortopedici Rizzoli” di Bologna, Italia (Serra et al, 1993). La linea U2/OS-DX è stata ottenuta esponendo la linea parentale sensibile a concentrazioni crescenti di DOX (Adriblastina, Pharmacia and Upjohn, Milano, Italia) fino a 580 ng/ml. Entrambe le linee cellulari sono state cresciute in terreno IMDM (Hyclone, Carmlington, UK) addizionato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) (Hyclone), 1% penicillina (50 U-ml)-streptomicina (Gibco Life Technologies, Paisley, UK), 1% di aminoacidi non essenziali, a 37 °C e in un’atmosfera contenente il 5% di CO2. Tutti i aggi ed i trattamenti delle cellule sono stati condotti in condizioni di assoluta sterilità, in maniera tale da evitare contaminazioni. A tale scopo è stata utilizzata una cappa a flusso laminare verticale, nella quale l’ambiente di lavoro è protetto da un flusso continuo e stabile di aria sterile che procede dall’alto verso il basso. Questo flusso costituisce inoltre una barriera in grado di impedire la fuoriuscita di aerosol pericolosi per l’operatore.

3.3 Reagenti

Il kit AnnexinV-FITC è stato fornito dalla Medical and Biological Laboratories Co., Ltd (Japan); esso consente di rivelare eventi precoci di apoptosi.

Lo Ioduro di propidio (PI) è un intercalante del DNA che penetra nelle cellule che hanno subito un danneggiamento della membrana plasmatica; è stato acquistato presso la Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA) ed usato alla concentrazione di 40 μg/ml.

La soluzione di Trypan blue 0.4% è stata acquistata presso la Sigma Chemical Company; il Trypan blue è in grado di colorare selettivamente le cellule morte. Il motivo per cui questo colorante non colora le cellule vive è da ricercarsi nell’estrema selettività della membrana cellulare. Le cellule vitali, avendo la membrana intatta, non permettono la penetrazione di questo colorante nel citoplasma.

La monodansilcadaverina (MDC), marker specifico dei vacuoli acidici, è stata acquistata presso la Sigma Chemical Company ed usata alla concentrazione di 50 mM.

I seguenti inibitori specifici del pathway autofagico sono stati acquistati presso la Sigma Chemical Company:

• la 3-metiladenina (3-MA) usata alla concentrazione di 1mM;

• la bafilomicina A1 (BAF) usata alla concentrazione 10 nM;

• la wortmannina (WM) usata alla concentrazione di 250 nM;

La Ciclosporina A (CsA), un noto immunosoppressore ed inibitore della P-gp, è stata usata alla concentrazione 5 μM e acquistata presso la Sigma Chemical Company.

Il 4’,6’-diamidine-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI), un colorante del DNA, è stato acquistato presso la Sigma Chemical Company.

Il Blu di metilene è un colorante basico in grado di penetrare liberamente attraverso la membrana plasmatica e di colorare nucleo nucleoli; è stato acquistato presso la Sigma Chemical Company.

3.4 Anticorpi utilizzati

La marcatura di un epitopo cellulare con anticorpi fluorescenti per evidenziare un antigene può essere fatta con il metodo diretto, in cui l’anticorpo che riconosce il target è legato ad una molecola fluorescente (fluorocromo), o con il metodo indiretto, in cui si procede con una prima incubazione con l’anticorpo che riconosce e lega l’epitopo che si intende marcare; successivamente, tale complesso è visualizzato con una immunoglobulina, coniugata con un fluorocromo, diretta contro il primo anticorpo.

L’immunofluorescenza indiretta, metodo da noi usato, offre il vantaggio di amplificare il segnale, poiché ad ogni molecola dell’anticorpo primario si possono legare varie molecole dell’anticorpo secondario, ottenendo in tal modo una maggiore intensità di marcatura.

Mediante citofluorimetria abbiamo studiato l’espressione della P-gp di superficie su cellule tumorali MDR.

Gli anticorpi utilizzati sono:

• UIC2: usato per studiare la modalità di interazione tra la VOA e la P-gp. Si tratta di un anticorpo monoclonale con isotipo IgG2a in grado di riconoscere un epitopo extracellulare della P-gp (Schinkel et al, 1993). La concentrazione usata è 6 μg/ml.

In tutti questi esperimenti è stato utilizzato, come anticorpo secondario, quello di

capra anti-mouse IgG coniugato con isotiocianato di fluoresceina (FITC).

• L’anticorpo monoclonale Anti-Bcl-2 (diluito 1:500) è stato fornito dalla Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

• L’anticorpo policlonale anti-LC3 (diluizione 1:500 per il Western blotting; diluizione 1:100 per l’analisi mediante microscopia confocale) è stato fornito dalla MBL (Woburn, MA, USA).

• Gli anticorpi monoclonale anti-PARP (diluito 1:500) e anti-α-tubulina (isotipo IgG, diluito 1:8000) sono stati forniti dalla Sigma.

Per il western blotting, gli anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano sono stati acquistati presso la Santa Cruz Biotechnology, mentre il kit con il substrato chemioluminescente (ECL) è stato acquistato presso la Amsterdam Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK).

Per la microscopia a fluorescenza è stato usato l’anticorpo secondario anti-rabbit IgG coniugato con FITC della Sigma.

3.5 Test di clonogenicità per la valutazione della sopravvivenza cellulare dopo trattamento combinato VOA/DOX

Gli esperimenti sono stati effettuati usando cellule a semi-confluenza trattate con DOX (1µg/ml) e VOA (1µg/ml), sia in combinazione che singolarmente. Sono state seminate 2x10³ cellule U2/OS-WT e 4x10³ cellule U2/OS-DX in fiasche per colture (60mm) e successivamente incubate a 37°C. La citotossicità è stata valutata usando il test di clonogenicità, in questo modo è stata valutata la capacità delle cellule di riprodursi e di formare colonie macroscopiche (oltre 50 cellule). Dopo 8 giorni, le colonie sono state fissate con etanolo 95°, colorate con Blu di metilene e contate manualmente. La percentuale di cellule sopravvissute è stata calcolata come rapporto tra la media del numero di colonie nei trattati e la media del numero delle colonie nei controlli.

3.6 Cenni sulla microscopia elettronica a scansione (SEM)

La microscopia elettronica a scansione permette lo studio della morfologia di superficie di campioni biologici opportunamente preparati e delle eventuali modificazioni indotte, per esempio, dal trattamento con agenti di varia natura, dall’instaurarsi di stati patologici o da variazioni delle condizioni ambientali.

Nel SEM il fascio elettronico emesso dalla sorgente viene opportunamente deflesso in modo da esplorare il campione punto per punto. Dall’interazione del fascio di elettroni incidenti con la superficie del campione si generano vari tipi di segnale (elettroni retrodiffusi, elettroni secondari, raggi X, elettroni Auger); quello normalmente utilizzato per ottenere informazioni morfologiche di superficie è costituito dagli elettroni secondari. Questi rappresentano gli elettroni degli orbitali esterni degli atomi del campione che, in seguito all’urto con gli elettroni del fascio incidente, vengono rimossi. Gli elettroni secondari emessi dallo strato più esterno del preparato (alcuni nanometri di profondità) sono raccolti da un opportuno rivelatore. L’immagine finale è visualizzata sullo schermo di un tubo a raggi catodici, collegato al rivelatore stesso. L’osservazione delle cellule al SEM prevede una preparazione del campione adeguata al tipo di segnale che si vuole utilizzare. Le fasi principali della preparazione sono costituite da:

• Deposizione delle cellule su vetrini coprioggetto circolari di diametro pari a 13 mm. Le cellule sono lasciate crescere fino a raggiungere una condizione di semiconfluenza.

• Fissazione e post-fissazione.

La fissazione è effettuata con glutaraldeide 2,5% in tampone cacodilato di sodio 0,2M, pH 7,2 per 30 minuti a temperatura ambiente (t.a.). Dopo lavaggi in tampone cacodilato 0,2M si procede a una post-fissazione con tetrossido di osmio (OsO4) all’1% in tampone cacodilato 0,2M, pH 7,2 per 30 minuti a t.a. I due composti agiscono su specifici costituenti cellulari (rispettivamente proteine e lipidi) mantenendo inalterata la loro struttura e i rapporti funzionali con gli altri componenti cellulari.

• Disidratazione.

È necessaria affinché il campione possa essere sottoposto alle condizioni di vuoto spinto presente all’interno della colonna del microscopio e consiste nella sostituzione dell’acqua intracellulare con etanolo o acetone attraverso una serie di incubazioni in soluzioni scalari crescenti dell’agente chimico utilizzato (nel nostro caso 30°, 50°, 70° e 100°).

• Essiccamento.

Si effettua con uno strumento, il critical point dryer (D), che sostituisce lentamente il solvente (etanolo o acetone) con CO2 liquida. Essendo la CO2 liquida non miscibile all’acqua, è necessario raggiungere valori di pressione e temperatura tali da far avvenire il aggio di stato senza l’attraversamento della linea di equilibrio (superamento del punto critico). In tale modo la CO2 viene trasformata in gassosa e il campione completamente essiccato. Questo metodo assicura il perfetto mantenimento delle ultrastrutture del campione senza alcuna modificazione morfologica.

• Ricopertura con metallo pesante.

I vetrini vengono montati su appositi i di alluminio (stubs) utilizzando una colla d’argento, che assicura la conducibilità elettrica tra o e superficie del campione, e ricoperti con uno strato di oro di 30 nm mediante un dispositivo di “sputtering” (SCD 040 Balzers). La formazione di un film ad elevata conducibilità termica ed elettrica protegge il preparato da danni dovuti al riscaldamento prodotto dall’interazione del fascio elettronico con il campione ed aumenta l’emissione degli elettroni secondari dalla superficie dello stesso.

Per gli studi al SEM, le cellule trattate e quelle di controllo sono state fatte crescere su vetrini con diametro di 13 mm e fissate con glutaraldeide 2,5% in tampone cacodilato 0,1M (pH 7,3), più saccarosio (2%), a temperatura ambiente per 20 minuti. Successivamente, è stato aggiunto OsO4 1% in tampone cacodilato 0,1M (pH 7,3) a temperatura ambiente per 30 minuti. Le cellule sono state disidratate con concentrazioni crescenti di etanolo, ed essiccate con il critica point dryer (D 030 Balzer device, Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) e rivestite con oro tramite un dispositivo di sputtering (SCD 040 Balzers device, Bal-Tec). I campioni sono stati poi esaminati con il microscopio elettronico a scansione Stereoscan 360 (Cambridge Instruments, Cambridge, UK).

3.7 Cenni sulla microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e metodo di preparazione dei campioni

La microscopia elettronica a trasmissione permette lo studio dei dettagli ultrastrutturali di un campione biologico. L’allestimento di un preparato per l’osservazione al TEM deve necessariamente condurre alla formazione di un campione estremamente sottile, in grado di essere attraversato dagli elettroni emessi dalla sorgente. Le fasi principali sono costituite da:

• Fissazione e post-fissazione

La fissazione è effettuata con glutaraldeide 2,5% in tampone cacodilato di sodio 0,2M, pH 7,2 per 30 minuti a temperatura ambiente (t.a.). Dopo lavaggi in tampone cacodilato 0,2M si procede a una post-fissazione con tetrossido di osmio (OsO4) all’1% in tampone cacodilato 0,2M, pH 7,2 per 30 minuti a t.a. I due composti agiscono su specifici costituenti cellulari (rispettivamente proteine e lipidi) mantenendo inalterata la loro struttura e i rapporti funzionali con gli altri componenti cellulari.

• Disidratazione

La disidratazione è stata eseguita con soluzioni a concentrazioni crescenti di alcool etilico: 30° per 10 minuti; 50° per 15 minuti; 70° per 15 minuti; 70° per 30 minuti con aggiunta di acetato di uranile all’1%, 90% per 30 minuti (due, tre cambi) e 100% per 1 ora (due, tre cambi).

• Infiltrazione e polimerizzazione

Le cellule vengono infiltrate da un appropriato mezzo di inclusione che ne aumenta la consistenza in modo da poter poi procedere all’operazione di taglio. In questo lavoro è stata utilizzata una resina epossidica, poiché è in grado di preservare i dettagli ultrastrutturali, ridurre al minimo l’estrazione dei componenti cellulari, infiltrare i tessuti e polimerizzare uniformemente senza introdurre distorsioni significative nella struttura della cellula. L’alcool etilico viene, quindi, gradualmente sostituito utilizzando soluzioni a concentrazioni crescente di resina in ossido di propilene fino ad arrivare al trattamento del preparato con resina assoluta. Raggiunta la completa infiltrazione del campione, si procede con la fase di polimerizzazione ad una temperatura di 65°C per 48 ore.

• Sezionamento

I principi fisici su cui si basa il cammino degli elettroni nel TEM, impongono la necessità di poter disporre di preparati di spessore minimo sufficiente per l’osservazione (tra i 60 e i 100 nm). Il sezionamento ultrasottile dei campioni inclusi viene effettuato mediante l’impiego di particolari strumenti denominati ultramicrotomi.

• Contrastazione delle sezioni

Il contrasto dell’immagine che si ottiene con un TEM tradizionale è direttamente proporzionale al numero atomico incontrato dall’elettrone lungo la traiettoria. Gli atomi presenti nei campioni biologici sono a basso numero atomico: è quindi necessario l’impiego di mezzi di contrasto ad elevato peso atomico che permettano di mettere in evidenza strutture che altrimenti non avrebbero sufficiente densità da indurre una deviazione degli elettroni utile alla formazione

di un’immagine ben visibile. Si utilizza il citrato di piombo in grado di reagire con i lipidi e il glicogeno. A questo punto le sezioni possono essere osservate e fotografate tramite microscopio elettronico a trasmissione (Philips EM208S).

Nei nostri esperimenti, dopo 24 h dalla semina, le cellule sono state trattate con VOA (1µg/ml) e DOX (1µg/ml) in combinazione e da sole, oppure con VOA (5 μg/ml) per 24 h. Quindi, le cellule sono state staccate con EDTA e tripsina e poi fissate con 2,5% glutaraldeide in 0,1 M di tampone cacodilato (pH 7,3) a temperatura ambiente per 20 min. Dopo fissazione con 1% di OsO4 in 0,2 M di tampone cacodilato (pH 7,3) a temperature ambiente per altri 30 minuti, le cellule sono state disidratate con concentrazioni crescenti di etanolo, e incubate in resina epossidica (TAAB Laboratories Equipment Limited, Aldermarton, UK). Le sezioni ultrasottili, ottenute con un ultramicrotomo LKB Ultratome Nova (LKB, Bromma, Sweden), sono state colorate con acetato di uranile e ate in citrato di piombo ed esaminate con il microscopio elettronico a trasmissione Philips 208 (FEI company, Eindhoven, The Netherland).

3.8 Freeze-fracturing

La tecnica del freeze-fracturing è una metodica molto importante per la valutazione ultrastrutturale delle membrane biologiche (Arancia, 1983). Essa offre, rispetto alle altre tecniche di preparazione per la microscopia elettronica, diversi vantaggi. Il campione biologico non deve essere sottoposto a numerosi trattamenti con agenti chimici che inevitabilmente alterano l’organizzazione molecolare delle membrane. Inoltre queste non devono essere separate dalla cellula e purificate, mantenendo in tal modo intatti i rapporti funzionali e strutturali con altri componenti cellulari. Infine, la tecnica del freeze-fracturing permette di osservare vaste superfici di membrana e non delle porzioni sottilissime come nel caso delle sezioni ultrasottili.

Il freeze-fracturing permette di ottenere una replica della superficie di frattura del campione, congelato a bassissima temperatura. Poiché la frattura avviene preferenzialmente lungo il piano idrofobico della membrana, tale tecnica è particolarmente adatta per la visualizzazione e per lo studio dell’organizzazione molecolare dei componenti della membrana. La prima fase di preparazione del campione consiste nel trattamento con sostanze (come il glicerolo) che servono a proteggerlo nella successiva fase di congelamento, che deve essere eseguita a temperatura bassissima (in Freon 22 e successivamente in N2 liquido) e ad altissima velocità (10⁴ °C/sec); solo in questo modo avviene la “vetrificazione” del campione, cioè la formazione di piccolissimi cristalli di ghiaccio che non danneggiano le strutture della cellula. Il campione congelato viene in seguito “fratturato” da una lama d’acciaio all’interno di un apparecchio sotto vuoto: la frattura attraversa dei piani preferenziali, cioè quelli contenenti un maggior numero di legami deboli, come appunto il piano idrofobico della membrana. La superficie di frattura ottenuta è sottoposta a due evaporazioni: la prima, di Pt-C, eseguita a 45°, dà il giusto contrasto e risoluzione al microscopio elettronico; la seconda, di C, eseguita a 90°, serve a rinforzare la replica. Questa viene successivamente lavata in soluzione acquosa di ipoclorito di sodio per rimuovere il materiale organico sottostante, così che ad essere osservato è il solo “calco” metallico della superficie fratturata. Essa appare caratterizzata da sporgenze e

avvallamenti che corrispondono alle strutture presenti sulla superficie della frattura. Osservando a forte ingrandimento entrambe le facce di frattura (PF e EF) delle membrane, è possibile rivelare delle particolari strutture globulari (IMP) le così dette “intramembrane particles”, che rappresentano la visualizzazione delle proteine immerse nel doppio strato lipidico. Lo studio delle dimensioni, distribuzioni e densità delle IMP è molto utile in quanto modificazioni di tali parametri ultrastrutturali riflettono spesso alterazioni funzionali, sia fisiologiche che patologiche, della cellula.

Per l’analisi al freeze-fracturing, le cellule di osteosarcoma di controllo e trattate sono state fissate con glutaraldeide 2,5% nel terreno di coltura subito dopo la fine del trattamento. Dopo 20 minuti di fissazione, le cellule sono state staccate e centrifugate per 10 minuti a 150xg, lavate due volte in Hank’s balanced salt solution (HBSS), risospese in medium contenente glicerolo 25% e incubate per 20 minuti a temperatura ambiente. La sospensione è stata poi centrifugata a 600xg per 15 minuti, e il pellet è stato posto su dei i ideali per il rapido congelamento in Freon 22, parzialmente solidificato alla temperatura dell’azoto liquido. I i, dopo il congelamento, sono stati trasferiti nello strumento Bal-Tec BAF 060 freeze-etch unit (BAL-TEC Inc., Balzers, Liechtenstein), criofratturati a –100 °C a una pressione di 2-4x10–7 mbar, ricoperti con un film di platino-carbone di spessore di 2,5 nm e con 20 nm di carbone. L’evaporazione del Platino-carbone viene effettuata ad un angolo di 45° e l’evaporazione del carbone a un angolo di 90° rispetto al campione in esame; lo spessore del deposito viene valutato tramite un cristallo di quarzo. Le repliche sono state esaminate con il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) Philips EM208S (FEI Company, Eindhoven, The Netherland).

3.9 Cenni sulla Microscopia confocale

La microscopia confocale a scansione laser (LSCM) è un importante metodica per la valutazione del legame esistente tra struttura e funzione in sistemi biologici. Utilizzando il microscopio convenzionale, le immagini ottenute sono comprensive dei segnali luminosi provenienti da strutture sopra e sottostanti il piano di fuoco. In microscopia confocale, invece, il contributo delle strutture fuori fuoco è notevolmente ridotto, ottenendo così, immagini tridimensionali di notevole definizione. La tecnica confocale consiste nell’illuminare un oggetto con un fascio luminoso puntiforme ottenuto da una sorgente laser focalizzata. Nella zona illuminata vi è un’emissione per fluorescenza o riflessione che viene catturata da un sistema ottico filtrato in modo tale da rivelare solo i segnali che provengono dal piano focale. Un sistema di scansione x-y-z dell’eccitazione puntiforme sull’oggetto e della relativa emissione permette l’analisi completa del campione. La raccolta delle sezioni ottiche consente la ricostruzione di un’immagine 3D composta da “voxel”. Il voxel, acronimo delle parole volume e pixel, rappresenta il più piccolo elemento indivisibile in un elemento tridimensionale.

La dimensione del voxel è definita dalla misura del pixel; la profondità del voxel è definita dalla distanza tra le sezioni o “step size”. Questi parametri sono stabiliti durante la fase di acquisizione. Il valore di ciascun voxel rappresenta la quantità di luce raccolta dal rivelatore del sistema ed è quantificata su una scala da 0 a 255. In questo modo le intensità dei voxel vengono sommate lungo raggi di proiezione perpendicolari al piano dello schermo. I filtri doppi dicroici sono filtri interferenziali ad un angolo di luce incidente di 45°C. La trasmittività e la riflettività di un doppio dicroico dipende dalle due lunghezze d’onda; l’eccitazione della luce a 488 nm e a 543 nm è riflessa e la luce d’eccitazione al disopra di questi valori è trasmessa.

Per valutare l’attività della P-gp, dopo trattamento delle cellule con VOA (10

μg/ml), è stata effettuata la localizzazione con l’anticorpo monoclonale MAb UIC2 che riconosce l’epitopo funzionale della P-gp; le cellule sono state fissate con paraformaldeide 3,7% più 2% di saccarosio, onde evitare alterazioni o dislocazioni dell’epitopo riconosciuto dall’anticorpo a seguito dell’interazione del fascio laser con le strutture cellulari.

Per l’osservazione dell’espressione della proteina LC3, marker caratteristico dell’autofagia, le cellule di osteosarcoma resistenti sono state trattate con DMSO (controllo), con VOA 5 μg/ml per 24 h e con 3-MA 1 mM per 3 ore (inibitore del fenomeno autofagico) più VOA. In seguito le cellule sono state fissate in 3,7% di paraformaldeide in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente (t.a.). La marcatura della proteina LC3 è stata effettuata con l’anticorpo policlonale antiLC3 (diluito 1:100) in camera umida per 30 minuti a 37°C. L’anticorpo secondario policlonale IgG FITC è stato utilizzato alla diluizione 1:500 per 30 minuti.

La lunghezza d’onda d’eccitazione è stata di 488 nm; la fluorescenza d’emissione è stata raccolta mediante un doppio filtro dicroico DD488/543 che consente una rivelazione di ampiezza di banda di 493-567 nm. I parametri d’acquisizione sono stati: obiettivo 63x/1,4, misura dell’immagine 1024x1024 pixels, misura del pixel di 0,5 µm, misura dello step di 0,5 µm. Le serie delle sezioni sono state elaborate con il metodo “maximun projection” che consente di ottenere un’immagine comprensiva di tutti i valori massimi di intensità presenti nelle sezioni stesse. Le osservazioni sono state eseguite con il microscopio spettrale confocale a scansione laser Leica TCS SP2 con sorgenti laser ArgonHelium-Neon (Leica Microsystems, Heidelberg GmbH, ).

3.10 Cenni sulla citofluorimetria

La citofluorimetria a flusso è una tecnica che permette di misurare i segnali di fluorescenza provenienti da una popolazione cellulare in sospensione. L’analisi citofluorimetrica è un’analisi multiparametrica e di alta significatività statistica. Essa permette una valutazione sia quantitativa (percentuale d’espressione) che qualitativa (misura dell’intensità e omogeneità d’espressione) dei diversi parametri. Una popolazione cellulare può essere studiata prendendo contemporaneamente in esame i parametri fisici, come volume e densità, biochimici, come il pattern antigenico e genetico, e funzionali come lo stato di attivazione cellulare e lo stato proliferativo. Per eseguire un’analisi citofluorimetrica è indispensabile disporre di sospensioni cellulari monodisperse. Le cellule di questa sospensione sono aspirate e fatte fluire singolarmente in una camera di flusso in maniera che le singole particelle incontrino, in questa sede, il raggio proveniente dalla sorgente luminosa (laser ad argon). La cellula così eccitata emette diversi segnali: segnale di scatter (che consente di distinguere le diverse popolazioni cellulari in base alle dimensioni e alla complessità interna) e segnale di fluorescenza (rappresentato dall’autofluorescenza prodotta dai composti flavinici della cellula o dalla fluorescenza specifica derivata dal trattamento con fluorocromi). Le misure di ciascun parametro sono espresse in unità arbitrarie dette canali, costituiti da livelli discreti in cui sono convertiti i segnali luminosi. L’utilizzo di unità arbitrarie fa sì che le misure possano essere solo di tipo relativo e si necessita, quindi, di un controllo negativo da utilizzare per azzerare il sistema. I citogrammi che sono prodotti dall’elaborazione statistica dei dati possono essere di due tipi: Istogramma monodimensionale, quando l’analisi è monoparametrica; Contour plot e dot plot, quando l’analisi è biparametrica, bidimensionale; Per il nostro studio è stato utilizzato un citofluorimetro a flusso LSRII della Becton Dickinson dotato di un laser a ioni di argon raffreddato ad aria con una potenza di 15 mW e che emette ad una lunghezza d’onda di 488 nm e di un laser Kimmon HeCd di 325 nm.

3.10.1 Marcatura della P-gp mediante anticorpo UIC2

L’anticorpo monoclonale IgG2a UIC2 riconosce un epitopo funzionale sui loop 1 e 3 della P-gp (Schinkel et al, 1993).

Per studiare l’effetto della voacamina sulla funzionalità della P-gp, le sospensioni cellulari sono state incubate in terreno di coltura IMDM contenente 2% di FBS per 10 minuti a 37°C. In seguito sono state trattate con VOA (10 μg/ml) per 15 minuti a 37°C e con Ciclosporina A (CsA) 5μM. Ogni sospensione cellulare trattata con le due sostanze è stata marcata con l’anticorpo UIC2 per 15 minuti a 37°C. Dopo alcuni lavaggi in PBS contenente 2% di FBS, le cellule sono state incubate con anticorpo secondario coniugato con FITC per 15 minuti a 4°C. Dopo lavaggi in PBS le cellule sono state analizzate immediatamente. Il controllo negativo è stato ottenuto incubando le cellule prima con un controllo isotipico e poi con il normale secondario allo scopo di evidenziare eventuali siti di legame aspecifici. La variazione di reattività dell’anticorpo è stata espressa come percentuale di shift: rapporto tra MFC (canale medio di fluorescenza) delle cellule trattate con VOA o CsA e MFC delle cellule di controllo.

3.10.2 Analisi del ciclo cellulare

Sono state seminate 1x10 cellule in terreno completo. Dopo 24 ore è stato effettuato il trattamento con VOA 5 µg/ml per altre 24 ore, mentre i controlli sono stati trattati con DMSO da solo. Successivamente le cellule sono state raccolte e lavate due volte con tampone PBS freddo e centrifugate. Il pellet così ottenuto è stato risospeso e fissato in etanolo a 70° per 1 ora, altri due lavaggi con PBS e successiva risospensione con PBS contenente PI 40 μg/ml e 100 μg/ml RNAse, incubazione a 37°C per 30 minuti. I campioni sono stati quindi analizzati attraverso il citofluorimetro.

3.10.3 Quantificazione dell’apoptosi attraverso marcatura Annexin V-FITC

Le cellule U2/OS-WT e le U2/OS-DX sono state trattate con VOA (1μg/ml) e con DOX (1μg/ml) sia in combinazione che da sole, per lo studio dell’effetto chemiosensibilizzante, o con VOA 5 μg/ml per 24 ore, per l’analisi dell’effetto citotossico dell’alcaloide. Successivamente le cellule sono state raccolte e marcate per 10 minuti a temperatura ambiente con Annexin V-FITC (1 μg/ml), e PI (40 μg/ml) e immediatamente analizzate al citofluorimetro.

3.10.4 Analisi morfologica dell’apoptosi tramite marcatura con DAPI

Sia i controlli che le cellule trattate con VOA (5μg/ml per 24 h), sono stati marcati con il DAPI (un colorante del DNA) alla concentrazione di 0,2 μg/ml; successivamente le cellule sono state fissate con paraformaldeide 3,7% in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente e osservate al microscopio a fluorescenza (Olympus BX 51, Tokyo, Japan).

3.10.5 Marcatura dei vacuoli autofagici con la monodansilcadaverina (MDC)

Per quantificare il processo autofagico in cellule di osteosarcoma trattate con VOA da sola (5 μg/ml per 24 ore), o in combinazione con gli inibitori dell’autofagia, come BAF (10 nM per 24 h), 3-MA (1 mM per 3 h) o WM (250 nM per 2 h), sono state valutate le cellule vitali che avevano incorporato la MDC. Le cellule sono state incubate con 50 μM MDC in PBS a 37 °C per 15 min. Dopo l’incubazione, le cellule sono state lavate con PBS, e immediatamente analizzate al citofluorimetro. La presenza di vacuoli autofagici, nelle cellule trattate e non, è stata visualizzata mediante microscopio a fluorescenza (Olympus BX 51).

3.11 Western blotting

Il western blotting è una tecnica biochimica che permette di identificare una determinata proteina in una miscela di proteine, mediante il riconoscimento da parte di anticorpi specifici; in generale, per facilitare il riconoscimento, la miscela di proteine viene prima separata in base alle loro dimensioni (o peso molecolare), mediante corsa elettroforetica utilizzando un gel di poliacrilammide (SDS-PAGE). In seguito le proteine vengono trasferite su di un o, che comunemente è una membrana di nitrocellulosa, e quindi si procede al riconoscimento vero e proprio della proteina mediante l’utilizzo di un anticorpo specifico (primario). Recentemente sono state messe a punto tecniche che permettono il riconoscimento antigene/anticorpo direttamente nella matrice del gel, evitando quindi il trasferimento su membrana. Questa tecnica si usa quando il campione corso è composto da una miscela di moltissime proteine tali che con una colorazione standard (blu coomassie o nitrato di argento) non si riuscirebbe a distinguerle l’una dall’altra, oppure quando, pur avendo bande ben distinte (discrete), la proteina di interesse è in quantità troppo basse per essere visualizzata con altre tecniche. Il western blotting attraverso tre aggi consente l’amplificazione del segnale, ciò rende visibili anche decimi di picomole (10-10mol) di proteina. In generale si utilizzano i di nitrocellulosa con porosità 0,45 μm; se le proteine da analizzare sono a basso peso molecolare, è consigliabile usare una porosità inferiore, ad esempio 0,2 μm. Occasionalmente vengono utilizzati i di PVDF (specialmente se la membrana servirà anche per il sequenziamento proteico) o nylon. A seconda dell’apparecchio usato, si parla di trasferimento semi-dry (se il tampone è fornito solo dalla carta assorbente) o wet (se il “sandwich” è immerso in una camera contenente soluzione tampone). Il trasferimento avviene applicando una corrente elettrica in un ambiente a pH basico (comunemente pH 8,5). In tal modo, le proteine migreranno verso l’anodo, in quanto ad un pH basico buona parte delle proteine è carica negativamente. Per accentuare la carica negativa delle proteine, si utilizza una soluzione di sodio-dodecil solfato (SDS) a bassa concentrazione (meno dell’1%) in quanto esso può inibire il legame delle proteine alla membrana. In genere si applicano 0,8 V per centimetro quadrato di superficie da trasferire, per un tempo minimo di 30 minuti ad un massimo di 16 ore, a seconda delle proteine da separare.

A questo punto si procede alla rivelazione diretta mediante un anti-anticorpo (secondario) legato all’enzima perossidasi di rafano (HRP). Questo enzima permette la conversione di un substrato solubile in uno non solubile, in stretta prossimità della proteina da rivelare. Un substrato chemioluminescente comunemente usato è il luminolo, che rivela la banda proteica e ne permette la visualizzazione mediante una lastra fotografica. La procedura quindi può essere separata in due parti: il trasferimento delle proteine e la rivelazione. In camera oscura viene preparato un volume pari a circa 10 ml di una soluzione composta di un ugual volume del reagente A e del reagente B del kit ECL (Amsterdam Pharmacia Biotech; Buckinghamshire, UK). Tale soluzione (reagente A più reagente B) viene poi versata in una vaschetta contenente la membrana, viene lasciata in incubazione per un minuto. Successivamente si lascia impressionare la lastra fotografica e, infine, si procede allo sviluppo e al fissaggio.

Nel nostro esperimento, le cellule di osteosarcoma, trattate e controllo, sono state lavate due volte con PBS freddo e lisate a 4 °C in 200 μl di buffer di lisi (TBS, 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 140 mM NaCl, 30 mM sodio pirofosfato, 5 mM EDTA, 0,55% Nonided P40, 1% Triton X-100, 50 mM NaF, 0,1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 1 mM benzamidine, 1 mM iodoacetamide, 1 mM phenantroline). I supernatanti sono stati ottenuti tramite centrifugazione a 17000xg per 30 minuti a 4 °C; la concentrazione proteica nei supernatanti è stata determinata tramite kit per la determinazione proteica (BCA protein assay; Pierce, Rockford, IL, USA). Aliquote di 40 μg del supernatante sono state quindi separate mediante elettroforesi SDS-PAGE. Le proteine sono state successivamente trasferite su membrane in PVDF e bloccate per una notte intera a 4 °C con 5% di latte (nonfat milk) in TTBS (TBS with 0,05% Tween 20). L’incubazione con gli anticorpi primari specifici e gli anticorpi secondari coniugati con HRP è stata eseguita con soluzione di bloccaggio per 1 h a temperatura ambiente. Le bande sono state visualizzate tramite kit SuperSignal West Pico Chemioluminescent substrate (Pierce).

3.12 Analisi statistica

I valori riportati nelle figure rappresentano la media ± la deviazione standard (SD) di tre esperimenti indipendenti. Le analisi statistiche eseguite usando il ttest Student’s. Le differenze sono state considerate significative quando l’indice di probabilità “p” risultava minore di 0,01.

4. RISULTATI

4.1 Effetto della VOA sulla citotossicità indotta dalla DOX

Per verificare il possibile effetto della VOA sull’attività citotossica della DOX, è stata valutata, mediante test clonogenico, la sopravvivenza delle cellule U2/OSWT e U2/OS-DX dopo trattamento con VOA (1µg/ml) e DOX (1µg/ml), da sole o in combinazione (Fig. 8). La VOA data da sola non influenza la sopravvivenza di entrambe le linee cellulari. Come ci si aspettava, l’esposizione alla DOX induceva un forte effetto citotossico sulla linea sensibile, risultando vitali soltanto una piccola percentuale di cellule (circa il 10%). Al contrario, le cellule resistenti non risentono dell’effetto citotossico indotto dalla DOX (95% di sopravvivenza). Sorprendentemente, quando il trattamento con DOX era preceduto dall’esposizione alla VOA, le cellule resistenti sopravvissute risultavano essere meno del 20%.

Fig. 8. Analisi della percentuale di sopravvivenza cellulare in seguito al trattamento delle cellule U2/OS-WT e delle cellule U2/OS-DX con VOA e DOX date in combinazione o singolarmente.

4.2 Osservazioni al Microscopio Elettronico a Scansione (SEM)

Per confermare l’effetto citotossico rivelato dopo trattamento combinato VOA (1μg/ml) più DOX (1μg/ml) su cellule resistenti rispetto ai trattamenti con i singoli farmaci, sono state effettuate analisi al SEM delle possibili alterazioni morfologiche. Le cellule di controllo, crescendo in modo adeso al substrato, mostravano la loro tipica morfologia caratterizzata da una forma poligonale e dalla superficie rivestita da microvilli distribuiti casualmente (Fig. 9a). Dopo trattamento con DOX o VOA somministrate da sole (Fig. 9b e Fig. 9c, rispettivamente), le cellule resistenti apparivano molto simili ai controlli in accordo con i dati del test di sopravvivenza cellulare. Al contrario, le cellule resistenti trattate con VOA più DOX mostravano evidenti segni di danno cellulare: retroazione cellulare per un possibile distacco dal substrato, forma rotondeggiante ed alterata distribuzione dei microvilli.

Fig. 9. Immagini di cellule U2/OS-DX ottenute al SEM: a) Controllo; b) Trattamento con DOX (1 μg/ml); c) Trattamento con VOA (1μg/ml); d) Trattamento con VOA (1μg/ml) e DOX (1μg/ml) in combinazione.

4.3 Effetto della VOA sulla conformazione della P-gp delle cellule resistenti

Le cellule resistenti U2/OS-DX sono caratterizzate dalla sovraespressione della P-gp, pompa d’efflusso di sostanze xenobiotiche. Per verificare se la VOA è un substrato della P-gp e se l’effetto citotossico della DOX osservato sulle cellule resistenti sia dovuto a un’azione competitiva dell’alcaloide vegetale sulla P-gp, è stata valutata la reattività di MAb UIC2, un anticorpo monoclonale capace di legarsi con elevata affinità alla conformazione attiva della molecola di trasporto. Le osservazioni al microscopio confocale eseguite su cellule U2/OS-DX hanno mostrato l’aumentata reattività dell’anticorpo UIC2 con la P-gp, in seguito al cambiamento conformazionale della molecola di trasporto dopo trattamento con la VOA. La fig. 10 mostra che l’intensità della fluorescenza in seguito a marcatura con UIC2 è molto più alta nelle cellule trattate (Fig. 10b) rispetto alle cellule di controllo (Fig. 10a). L’effetto del trattamento con la VOA è stato confermato mediante citofluorimetria che ha dimostrato una reattività dell’anticorpo verso l’epitopo della P-gp simile a quella indotta dalla CsA, noto substrato della P-gp e revertante della MDR (Fig. 11).

Fig. 10. Immagini, ottenute mediante microscopio confocale, che evidenziano la marcatura di UIC2 sulla linea U2/OS-DX: a) controllo; b) trattamento con VOA (10 μg/ml).

Fig. 11. Analisi citofluorimetrica delle U2/OS-DX in seguito a trattamento con VOA (10 μg/ml ) e CsA (5μM).

4.4 Caratterizzazione della morte cellulare indotta in seguito a trattamento voacamina/doxorubicina

Per chiarire se l’aumentato dell’effetto citotossico della DOX indotto dalla VOA osservato su cellule U2/OS-DX fosse dovuto ad una induzione di morte cellulare per apoptosi, abbiamo valutato l’indice apoptotico attraverso la marcatura con Hoechst e con il test dell’Annessina. La Fig. 12a mostra le cellule resistenti di controllo in cui i nuclei appaiono ben preservati, con una distribuzione normale della cromatina. Dopo trattamento con i due farmaci, molti nuclei risultano rigonfi senza alcun segno evidente di apoptosi, come la condensazione della cromatina e la frammentazione nucleare (Fig. 12b).

Fig. 12. Cellule U2/OS-DX marcate con Hoechst confermano che non c’è apoptosi: a) Controllo; b) VOA (1μg/ml) e DOX (1μg/ml) in combinazione.

I risultati dell’analisi citofluorimetrica eseguita su cellule resistenti dopo doppia marcatura con Annessina V-FITC e Trypan Blue sono mostrati in fig. 13. Nel controllo la popolazione di cellule marcate con Trypan blue è di circa il 15%, mentre è molto bassa (5%) la percentuale di cellule sicuramente apoptotiche positive all’Annessina V. Queste percentuali non cambiano significativamente dopo trattamento con VOA o DOX date da sole. Quando i due agenti vengono somministrati in associazione, la percentuale di cellule Trypan blue positive risulta molto più alta (circa il 60%), la maggior parte di queste però sono Annessina V negative mentre la percentuale di Annessina V positive-Trypan blue negative non aumenta. Questi dati dimostrano che l’apoptosi avviene in una piccola percentuale di cellule morte, e quindi le cellule trattate con VOA/DOX muoiono attraverso altri meccanismi di morte cellulare. È stato recentemente dimostrato che alcuni agenti usati nella terapia antitumorale inducono autofagia, ma non apoptosi. Abbiamo quindi voluto verificare se questo tipo di morte programmata fosse coinvolto nei meccanismi di citotossicità indotta dalla VOA sulle cellule U2/OS-DX. A tal proposito, le cellule di osteosarcoma sono state analizzate mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per verificare l’eventuale presenza di alterazioni ultrastrutturali caratteristiche della morte cellulare per autofagia. Le osservazioni al TEM hanno confermato le indagini ottenute con il test di sopravvivenza cellulare e mostrano chiaramente le caratteristiche tipiche dell’autofagia in cellule trattate con VOA/DOX. Dopo l’esposizione a 1µg/ml di VOA e a 1 µg/ml di DOX date da sole, le cellule mostravano un’ultrastruttura ben preservata (Fig. 14b) senza alcun segno di danno cellulare, apparendo molto simili alle cellule di controllo (Fig. 14a).

Differentemente, dopo il trattamento con entrambi i componenti, molte cellule resistenti presentano un citoplasma vacuolizzato e gli organelli intracellulari alterati morfologicamente (Fig. 14c). Sono stati osservati, in cellule trattate con VOA/DOX, numerosi vacuoli con all’interno residui citoplasmatici e lisosomi. L’immagine a forte ingrandimento, conferma la presenza nei vacuoli di materiale

di diversa natura, come strutture lamellari, residui di organelli digeriti e corpi granulari densi (Fig. 14d). Queste osservazioni indicano che le cellule resistenti trattate con VOA più DOX potevano essere andate incontro a morte cellulare per autofagia.

Fig. 13. Analisi citofluorimetrica della morte cellulare eseguita su cellule U2/OS-DX trattate con VOA e DOX in combinazione e da sole.

Fig. 14. Immagini ottenute tramite Microscopia Confocale a Trasmissione (TEM): a) U2/OS-DX trattate con VOA (1 μg/ml); b) U2/OS-DX trattate con DOX (1 μg/ml); c) VOA e DOX date in combinazione; d) Ingrandimento di (c).

4.5 Effetto della VOA sulla sopravvivenza di cellule di osteosarcoma ed alterazioni morfologiche correlate

Le osservazioni fin qui descritte avevano lo scopo di verificare l’effetto chemiosensibilizzante della VOA. Le cellule di osteosarcoma farmacoresistenti sono state perciò intenzionalmente trattate con concentrazioni non citotossiche dell’alcaloide vegetale per tempi brevi. Poiché lo scopo principale dell’attività sperimentale di questa tesi è stato quello di chiarire i meccanismi dell’attività citotossica della VOA, nonché i meccanismi di morte cellulare da essa indotti, i trattamenti sono stati eseguiti a concentrazioni più elevate e per tempi prolungati.

La figura 15 mostra la percentuale di sopravvivenza delle cellule U2/OS WT e U2/OS DX attraverso la positività al Trypan Blue, dopo trattamento a diverse concentrazioni di VOA (1; 2.5; 5; 10 μg/ml) per 24, 48 e 72 ore. È ben visibile una riduzione della sopravvivenza sia in relazione all’aumentare delle concentrazioni che della durata del trattamento. Il trattamento a basse concentrazioni di VOA (1μg/ml) per 24 ore aveva scarso effetto sia sulle U2/OS WT che sulle U2/OS DX; alla concentrazione di 5 μg/ml per 24 h, la vitalità cellulare si riduceva di circa il 50% ; al 30-40% dopo 48 h e solo al 20% dopo 72 h. E’ da notare che ad ogni concentrazione e tempo di trattamento, le cellule resistenti risultavano essere meno sensibili alla VOA, probabilmente a causa della maggiore espressione della P-gp nella membrana plasmatica (Meschini et al, 2005).

La microscopia ottica a contrasto di fase ci ha permesso di evidenziare, a parità di dose e trattamento, una riduzione del numero di cellule adese al substrato e la presenza di vacuoli nelle cellule trattate con VOA sia nella linea sensibile che in quella resistente (Fig. 16c e 16d, rispettivamente) rispetto ai relativi controlli (Fig. 16a e 16b).

Figura 15. Percentuale di cellule U2/OS-WT e -DX sopravvissute in seguito a trattamento con VOA in modo dose-dipendente (1, 2.5, 5, 10 μg/ml) e tempo dipendente (24, 48 e 72 ore).

Fig. 16. Osservazioni attraverso il Microscopio a Contrasto di Fase: a) Controllo U2/OS-WT; b) Controllo U2/OS-DX; c) U2/OS WT trattate con VOA (5 μg/ml per 24 h); d) U2/OS-DX trattate con VOA (5 μg/ml per 24 h).

4.6 Analisi della possibile induzione dell’apoptosi nelle cellule di osteosarcoma trattate con VOA

Per valutare se l’effetto della VOA fosse quello di indurre apoptosi, è stato analizzato il ciclo cellulare mediante citofluorimetria dopo colorazione con PI. Nella linea sensibile, dopo trattamento con VOA (5 μg/ml per 24 h) le cellule risultano principalmente in fase G1 (54%) rispetto al controllo (38%), come mostrano le figure 17c e 17a rispettivamente. Nella linea resistente (U2/OS-DX) non si osserva un accumulo preferenziale in alcuna fase del ciclo cellulare, il profilo citofluorimentrico risultando molto simile al controllo (Fig. 17b e 17d, rispettivamente). È importante notare che in queste condizioni di trattamento, in entrambe le linee non si osserva la presenza di un picco ipo-diploide caratteristico della morte per apoptosi.

La colorazione con DAPI e l’osservazione mediante microscopia ottica a fluorescenza (Fig. 18) non hanno rivelato segni morfologici di apoptosi (condensazione e frammentazione nucleare), in entrambe le linee cellulari dopo trattamento con VOA.

Fig. 17. Analisi del ciclo cellulare: a) Controllo U2OS-WT; b) Controllo U2/OS-DX; c) U2/OS–WT trattate con VOA (5 μg/ml per 24 h); d) U2/OS– DX trattate con VOA (5 μg/ml per 24 h).

Fig. 18. Colorazione con DAPI: a) Controllo U2/OS-WT; b) Controllo U2/OS-DX; c) U2/OS-WT trattate con VOA (5 μg/ml per 24 h); d) U2/OSDX trattate con VOA (5 μg/ml per 24 h).

La valutazione dei parametri biochimici e morfologici ha confermato la non attivazione del pathway apoptotico. È stata analizzata l’esposizione superficiale della fosfatidilserina, evento primario del programma apoptotico. Le cellule trattate con VOA (5 μg/ml per 24 h), sono state marcate con ioduro di propidio (PI) e con annessina V coniugata con FITC ed analizzate in citofluorimetria (figura 19). Nell’esperimento rappresentativo riportato, i controlli delle U2/OS WT e delle U2/OS DX mostrano una percentuale di cellule Annessina Vnegative e PI-negative del 94.5% e del 96.2%, rispettivamente. Queste percentuali diminuiscono significativamente (47.6% e 50.8%) dopo trattamento con VOA. La percentuale totale delle cellule permeabili allo ioduro di propidio è del 45.9% per le U2/OS WT e del 40.1% per le U2/OS DX, mentre le annessina V-positive e PI-negative (cellule in apoptosi) è del 6.5% (U2/OS-WT) e del 9.1% (U2/OS-DX). Questi risultati sembrano suggerire che l’apoptosi avviene solo in una piccola percentuale di cellule morte. L’analisi tramite Western blotting del taglio della polimerasi ADP-ribosilasi (PARP), ampliamente accettato come marcatore dell’apoptosi (Patel et al, 1996), ha ulteriormente dimostrato l’assenza di tale fenomeno nelle cellule di osteosarcoma trattate con VOA.

Fig. 19. Analisi citofluorimetrica di cellule trattate con VOA 5 μg/ml per 24 h; sono state successivamente doppiamente marcate con ioduro di propidio (PI) e con annessina coniugata con V-FITC

Fig. 20. Western blotting: analisi di PARP e Bcl-2 dopo trattamento con VOA tempo- e dose-dipendente delle linee cellulari U2/OS-WT e U2/OS-DX.

Dopo trattamento con VOA (1 μg/ml e 5 μg/ml per 24, 48 e 72 h) è presente solo la banda di 116 kDa; l’assenza della banda di 85 kDa in tutti i campioni indica l’assenza totale di apoptosi (figura 20). È stata valutata inoltre l’alterazione dell’espressione di Bcl-2 dopo trattamento con VOA. La proteina Bcl-2 è noto reprimere il pathway apoptotico (Danial and Korsmeyer, 2004). La VOA non altera l’espressione della proteina Bcl-2, la banda di 26 kDa rimane ugualmente espressa dopo il trattamento (figura 20).

Le osservazioni al microscopio elettronico a scansione (SEM) hanno evidenziato, in entrambe le linee di osteosarcoma trattate con VOA, segni di danno cellulare, anche se la maggior parte delle cellule non mostrava segni morfologici tipici di cellule in apoptosi (Fig. 21).

Figura 21. Osservazioni al SEM sulla linea cellulare U2/OS-WT: a) Controllo; b) VOA 5 μg/ml.

4.7 La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) rivela la formazione di autofagosomi in cellule di osteosarcoma trattate con VOA

Le cellule di osteosarcoma trattate con VOA e i rispettivi controlli sono stati osservati con il microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Le cellule di controllo, U2/OS-WT e U2/OS-DX (Fig. 22a e Fig. 22b, rispettivamente), sono caratterizzate dalla presenza di un citoplasma compatto e ben preservato, un nucleo con contorni regolari e cromatina dispersa.

Figura 22. Immagini ottenute al TEM: a) Controllo U2/OS-WT; b) Controllo U2/OS-DX; c) U2/OS-WT trattate con VOA 5 μg/ml per 24 h; d) U2/OS-DX trattate con VOA 5 μg/ml per 24 h; e) Maggior ingrandimento di (c); f) Maggior ingrandimento di (d).

Dopo trattamento con VOA (5 μg/ml per 24 h), la maggior parte delle cellule U2/OS WT presenta un gran numero di vacuoli autofagici, ovvero vescicole con doppia membrana contenenti materiale di degradazione (figura 22c). Nel citoplasma delle cellule U2/OS DX trattate con VOA sono presenti strutture vacuolari elettrondense, circondate da figure simil-mieliniche (figura 22d). Le figure 22e e 22f a maggior ingrandimento mostrano il contenuto e la struttura complessa degli autofagosomi delle cellule sensibili e delle cellule resistenti trattate con l’alcaloide vegetale. La formazione di queste vescicole membranose aumenta progressivamente con l’aumentare della concentrazione. È interessante notare che l’assemblaggio generale così come la struttura degli autofagosomi sembra essere differente tra le cellule sensibili e le cellule resistenti. In particolare, nelle U2/OS-WT le vescicole hanno una forma più definita e uniforme (figura 22e) mentre nelle U2/OS-DX le vescicole hanno una struttura irregolare con diverse forme e un’organizzazione disordinata (figura 22f). Coerentemente con le osservazioni al SEM, non sono presenti caratteristiche morfologiche delle cellule in apoptosi.

Mediante la tecnica del freeze-fracturing è stato possibile approfondire e valutare le modificazioni presenti nell’organizzazione molecolare della membrana plasmatica. La densità e la distribuzione delle proteine di membrana (intramembrane particles: IMPs) su entrambe le facce di frattura della membrana plasmatica non sembrano essere alterate in seguito al trattamento con VOA, suggerendo che questa sostanza naturale non altera l’architettura generale della membrana (dato non mostrato). Quando il piano di frattura attraversa la cellula è possibile evidenziare la parte citoplasmatica, visualizzando così i numerosi vacuoli presenti nelle cellule trattate con VOA , sia sensibili (Fig. 23a) che resistenti (Fig. 23b). Le analisi a maggior ingrandimento rivelano che nelle U2/OS-WT la maggior parte dei vacuoli sono delimitati da membrane

lipoproteiche contenenti IMPs (Fig. 23c), mentre nelle U2/OS-DX alcuni vacuoli sono circondati da membrane lisce multi lamellari (Fig. 23d). Nelle cellule resistenti trattate con VOA sono stati trovati alcuni complessi multi-vescicolari contenenti organelli citoplasmatici. Nella figura 23f si osserva un mitocondrio degenerato all’interno di un vacuolo autofagico.

Figura 23. Caratterizzazione mediante freeze-fracturing di cellule di osteosarcoma dopo trattamento con VOA (5 μg/ml): a) vacuoli presenti nella linea U2/OS-WT; b) vacuoli presenti nella linea U2/OS-DX; c) ingrandimento di (a) con visualizzazione delle IMP; d) ingrandimento di (b) con presenza di membrane lisce multi-lamellari; e) ingrandimento di (c); f) caratterizzazione di un mitocondrio.

4.8 Rivelazione della presenza di organelli vescicolari acidici (AVOs) in cellule di osteosarcoma trattate con VOA

Una sostanza autofluorescente, la monodansilcadaverina (MDC), è stata utilizzata per verificare la presenza di vacuoli autofagici precedentemente osservati mediante il TEM e il freeze-fracturing. La MDC è un marker selettivo degli organelli vescicolari acidici (AVOs) in particolare di vacuoli autofagici e di autofagosomi (Biederbick et al, 1995). Mediante microscopia ottica a fluorescenza e citofluorimetria è stata quindi valutata l’incorporazione della MDC in cellule di osteosarcoma umano, sensibile e resistente, trattate con VOA (5 μg/ml per 24 h). In seguito sono stati utilizzati noti inibitori del processo autofagico quali la 3-metiladenina (3-MA), la bafilomicina A1 (BAF) e la wortmannina (WM). La 3-MA (Seglen and Gordon, 1982) e la WM, inibitori della PI3-chinasi, (Blommaart et al, 1997) bloccano l’autofagia nelle prime fasi mentre la BAF, un inibitore specifico della pompa vacuolare H+-ATPase, previene l’autofagia nella fase finale inibendo la fusione tra autofagosoma e lisosoma (Yamamoto et al, 1998).

Come mostrato in figura 24, la VOA (5 μg/ml per 24 h) induce un evidente accumulo di MDC in entrambe le linee cellulari. L’aumento dell’intensità della fluorescenza dovuta alla maggior incorporazione di MDC è più evidente nella linea U2/OS-DX che nella controparte sensibile U2/OS-WT (figure 24b e 24a, rispettivamente). Gli inibitori dati da soli presentano una fluorescenza simile al controllo. In entrambe le linee cellulari, la pre-incubazione con uno dei tre inibitori induce una significativa riduzione della positività alla MDC, rispetto alle cellule trattate soltanto con VOA. L’effetto degli inibitori autofagici sull’incorporazione della MDC in cellule trattate con VOA è stato confermato mediante microscopio a fluorescenza. In riferimento alla figura 25, nelle cellule di controllo U2/OS-DX e in quelle trattate con BAF più VOA si può notare una scarsa positività per la MDC. Le cellule trattate con VOA invece mostrano numerosi vacuoli citoplasmatici positivi alla MDC che vengono fortemente ridotti se le cellule sono pre-trattate con BAF.

Fig. 24. Variazione, mediante analisi citofluorimetrica, dell’incorporazione della MDC in seguito a trattamento delle cellule U2/OS-WT e delle cellule U2/OS-DX con tre diversi inibitori dell’autofagia, dati singolarmente o in associazione con la VOA.

Fig. 25. Immagini ottenute attraverso il microscopio a fluorescenza: variazione di incorporazione della MDC dopo trattamento con BAF (10 nM per 24 h),VOA (5 μg/ml per 24 h) e BAF più VOA in combinazione.

4.9 Conversione di LC3 indotta dalla VOA

La conversione della proteina LC3 dalla forma LC3-I (18 kDa), libera nel citoplasma, alla forma LC3-II (16 kDa), presente nelle membrane degli autofagosomi, è uno degli elementi principali per la valutazione del processo autofagico in cellule di mammifero (Kabeya et al, 2000; Kabeya et al, 2004; Tanida et al, 2004). Per verificare ulteriormente la presenza di tale fenomeno è stata valutata l’espressione della proteina LC3 tramite Western blotting e microscopia confocale. L’analisi è stata effettuata sia dopo trattamento con VOA (1 e 5 μg/ml per 24 h) sia quando la VOA veniva preceduta dall’inibitore 3-MA. Sono state esaminate entrambe le forme LC3-I e LC3-II nelle due linee cellulari. E’ stato rivelato un evidente aumento di LC3-II dose-dipendente in entrambe le linee cellulari dopo trattamento con VOA. Nelle U2/OS-DX, la VOA causa da sola un forte aumento dei livelli di LC3-I. Il pre-trattamento con l’inibitore 3MA provoca una riduzione significativa di LC3-II in entrambe le linee cellulari. I livelli di espressione di LC3-II erano più bassi nelle cellule trattate prima con 3-MA seguita dal trattamento con VOA 5 μg/ml per 24 h (Figura 26: 3-MA + V5) rispetto alle cellule trattate con VOA da sola (figura 26: V5). L’aumento dell’espressione di LC3 dopo trattamento con VOA e la riduzione in caso di pretrattamento con 3-MA è stato confermato anche dalle osservazioni al microscopio in confocale. Nel controllo e nelle cellule trattate con la combinazione 3-MA più 5 μg/ml VOA (figure 27a e 27c, rispettivamente) il segnale fluorescente era debole e diffuso, mentre nelle cellule trattate con la VOA da sola (figura 27b) si possono osservare numerosi spot fluorescenti presenti nelle vescicole citoplasmatiche.

Fig. 26. Western blotting effettuato per determinare la presenza delle due forme di LC3 in seguito al trattamento di U2/OS-WT e di U2/OS-DX con VOA e 3-MA date singolarmente e in combinazione.

Fig. 27. Immagini ottenute attraverso il microscopio a confocale della marcatura di LC3, sulle cellule U2/OS-DX: a) controllo; b) trattamento con VOA (5 μg/ml per 24 h); c) combinazione 3-MA/VOA.

5. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI

La principale caratteristica delle cellule tumorali farmacoresistenti è rappresentata dall’aumento dell’espressione delle proteine di trasporto, come la P-gp, il cui effetto è quello di ridurre la concentrazione intracellulare di farmaci antitumorali (Gottesman and Pastan, 1993). I risultati ottenuti nel corso di questo lavoro dimostrano che la sostanza naturale VOA è in grado di aumentare la sensibilità delle cellule tumorali di osteosarcoma umano al trattamento con la DOX. L’alcaloide vegetale VOA infatti, dato in combinazione con la DOX in cellule tumorali resistenti, induce una variazione nella conformazione della P-gp, favorendo una maggiore esposizione dell’epitopo riconosciuto dall’anticorpo UIC2. L’aumento dose-dipendente della reattività di UIC2 ha suggerito che la VOA è un substrato della P-gp e che può competere con la DOX nella fase di efflusso del farmaco favorendone la ritenzione. L’osservazione, mediante microscopia elettronica a trasmissione, delle cellule U2/OS-DX trattate con la combinazione VOA/DOX ha dimostrato la presenza di numerose strutture vacuolari contenenti residui di materiale citoplasmatico. Non si sono però osservate alterazioni morfologiche tipiche dell’apoptosi; ciò ha incrementato l’interesse verso la comprensione del meccanismo di morte cellulare indotto dalla VOA e del suo possibile ruolo nel processo autofagico. Alcuni studi hanno dimostrano che l’autofagia può inibire l’apoptosi proteggendo le cellule tumorali dal danno citotossico (Codogno and Meijer, 2005), o indurre morte cellulare autofagica (Kondo et al, 2005). Tuttavia, in alcuni casi, una parte della popolazione cellulare presenta cellule in apoptosi e un’altra parte in autofagia, ad indicare la complessità nella comprensione e distinzione di tali fenomeni (Bursh et al, 1996). I risultati fino ad ora presentati dimostrano che l’effetto chemiosensibilizzante della VOA nella citotossicità della DOX in cellule resistenti, è dovuto a un meccanismo autofagico incontrollato. Lo studio è proseguito nel tentativo di capire se la VOA, data da sola ad entrambe le linee di osteosarcoma (sensibili e resistenti), potesse indurre una morte alternativa all’apoptosi, come è stato visto per altre sostanze naturali (Fengsrud et al, 1995; Rez and Kovacs, 1996). Le curve di sopravvivenza cellulare dose-risposta, dopo trattamento per tempi prolungati, hanno rivelato che entrambe le linee cellulari mostravano una vitalità di circa il 50% in seguito a trattamento con VOA 5

µg/ml per 24 ore. L’effetto citotossico della VOA non era dovuto però all’induzione dell’apoptosi perché l’analisi del ciclo cellulare e le osservazioni al microscopio in seguito a marcatura con DAPI non rivelava segni tipici dell’apoptosi. In particolare, l’analisi al citofluorimetro dell’espressione della fosfatidilserina, rivelata mediante il test dell’Annessina V/PI su cellule trattate, evidenziava una percentuale minima (circa il 10%) di cellule apoptotiche Annessina-positive/PI-negative. Le cellule Annessina-positive/PI-negative non sempre corrispondono a cellule apoptotiche. Lecoeur e Gougeon hanno dimostrato che l’esposizione della fosfatidilserina sulla membrana plasmatica dopo un trattamento citotossico, può indicare una fase iniziale della necrosi cellulare (Lecoeur and Gougeon, 2001). Per quanto riguarda le cellule Annessina-positive/PI-positive, il loro aumento in seguito a trattamento potrebbe essere dovuto a un danno della membrana plasmatica per induzione del programma autofagico. Tra le proteine coinvolte nel controllo dell’apoptosi, i membri della famiglia Bcl-2 sono stati ampiamente messi in rilievo (Sharpe et al, 2004). In particolare, Bcl-2 è stata la prima proteina cellulare identificata come inibitore della morte cellulare apoptotica. Nei nostri modelli sperimentali, anche dopo trattamento prolungato con VOA, non è stata osservata alcuna variazione nell’espressione di Bcl-2. Recentemente è stato tuttavia dimostrato che la famiglia delle proteine Bcl-2 non solo regola il pathway apoptotico ma controlla anche il programma di morte cellulare in cui sono coinvolti geni autofagici (Shimizu et al, 2004; Pattingre and Levine, 2006). La mancata presenza del frammento di 85 kDa di PARP in cellule di osteosarcoma trattate con VOA (1 e 5 µg/ml per 24, 48 e 72 ore) rappresenta un’ulteriore dimostrazione dell’assenza del processo apoptotico (Patel et al, 1996). Tutte queste evidenze, confermate dalle osservazioni mediante microscopia, sono in accordo con l’assenza dell’apoptosi dopo trattamento con VOA e suggeriscono fortemente un programma di morte autofagico. La microscopia elettronica a trasmissione ci ha permesso di dimostrare la presenza di autofagosomi, contenenti materiale di diversa struttura, complessità e densità elettronica, in cellule sensibili e resistenti dopo trattamento con VOA. Le caratteristiche ultrastrutturali e morfologiche dei vacuoli autofagici, appaiono tuttavia diverse tra cellule sensibili e resistenti. È possibile ipotizzare che l’involucro delle vescicole autofagiche complesse osservate nelle cellule MDR, potrebbe riflettere una differenza nella composizione lipidica delle loro membrane cellulari. È stato dimostrato infatti che nei linfoblasti leucemici resistenti alla vinblastina, il contenuto di colesterolo e fosfolipidi totali risulta aumentato del 50% e del 30% rispettivamente, mentre il rapporto lipidi/proteine risultava aumentato del 60% (May et al, 1988). L’analisi approfondita della struttura delle membrane

mediante la tecnica del freeze-fracturing, oltre ad aver confermato il notevole aumento delle vescicole nelle cellule trattate, ha fornito anche dettagli ultrastrutturali sulla formazione degli autofagosomi e sulle loro differenze strutturali tra linea cellulare sensibile e linea resistente. Nelle nostre immagini ottenute al freeze-fracturing, si possono distinguere le diverse fasi della formazione dell’autofagosoma, visualizzando la presenza di vacuoli rivestiti o meno di doppia membrana e di eventuali proteine associate (IMPs). Per completare le osservazioni al microscopio elettronico e sostenere l’ipotesi di una citotossicità di tipo autofagico nei nostri modelli cellulari, sono state utilizzate altre tecniche quali la microscopia a fluorescenza e la citofluorimetria, per l’analisi e l’incorporazione della MDC, il Western blotting e il microscopio confocale, per lo studio dell’espressione della proteina LC3. La MDC viene utilizzata preferenzialmente per evidenziare la presenza e l’accumulo di organelli vescicolari acidici (Biederbick et al, 1995). Il trattamento con VOA induce un forte aumento dell’incorporazione di MDC che viene notevolmente ridotto se le cellule sono pretrattate con differenti inibitori dell’autofagia (BAF, 3-MA o WM). La proteina LC3 è considerata un indicatore della presenza del fenomeno autofagico, in quanto funziona come elemento fondamentale per la formazione degli autofagosomi (Kabeya et al, 2000; Kabeya et al, 2004; Tanida et al, 2004). Nel nostro modello sperimentale, l’espressione della molecola coniugata con un fosfolipide (LC3-II) aumenta notevolmente in maniera dose-dipendente quando le cellule di osteosarcoma, sensibili e resistenti, vengono trattate con la voacamina da sola. Nel caso invece di pre-trattamento con 3-MA, noto inibitore dell’autofagia, si osserva una riduzione dell’espressione della proteina LC3-II. Questo indica che la 3-MA è efficace ed impedisce la conversione della proteina LC3-I in LC3-II, impedendo l’avanzamento del processo autofagico.

In conclusione, il nostro lavoro ha portato all’ipotesi che la voacamina induce un meccanismo di morte cellulare per autofagia su cellule di osteosarcoma sensibili e resistenti. Le ricerche ancora in corso indicano inoltre che un tal effetto non è esclusivo delle cellule di osteosarcoma umano ma è presente anche in altri tipi di cellule tumorali, quali il carcinoma del colon ed il glioblastoma. La capacità chemiosensibilizzante della VOA, nonché l’induzione di morte cellulare per autofagia, rende questa sostanza particolarmente interessante per la futura terapia anti-tumorale in cellule resistenti all’apoptosi. In futuro si potrebbe pensare di chiarire meglio i meccanismi attraverso i quali la VOA induce attivazione del pathway autofagico e verificare se questo effetto è esercitato anche quando viene

somministrata in combinazione con altri farmaci antitumorali.

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