Exoenzimas-anabolismo 3nl61

Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia, Microbiología General.

RESULTADOS (Práctica 7) Se realizaron siembras en tres medios de cultivo diferentes: agar DNAsa, agar Almidón y agar Caseína a partir de tres cultivos patrón: Serratia marcensis, Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus, evaluando los resultados con unas gotas de HCl y lugol para observar la formación o no de un halo alrededor de las colonias, obteniendo las imágenes dadas a continuación.

Fig. 1 Agar DNAsa

Fig. 2 Agar Almidón

Fig. 3 Agar Caseína

Los resultados de las observaciones de cada colonia se recopilan en la tabla 1, positivas según la aparición de una zona claramente definida alrededor de cada punto de crecimiento después de la incubación y adición de HCl, a la vez que negativas si no se muestran cambios. Producción de exoenzimas Serratia marcensis Bacillus subtilis Staphylococcus aureus

DNAsa + +

Amilasa + -

Proteasa + + +

Tabla 1. Producción de exoenzimas según medios de cultivo

ANÁLISIS DE RESULTADOS Con base en la composición previamente conocida del agar DNAsa, se infiere que los aminoácidos, nitrógeno y nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano están dados tanto por la peptona de caseína como por la peptona de soya; así mismo el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico. La concentración de ácido desoxirribonucleico (DNA) permite diferenciar entre bacterias que poseen la enzima desoxirribonucleasa (DNAsa) de aquellas que no, cuya presencia se detecta con HCl, puesto que los microorganismos que degradan el ADN producen una zona transparente alrededor del área de crecimiento, ya que la DNAsa hidroliza al DNA, dando lugar a zonas claras que indican que éste ha sido dividido en fracciones de nucleótidos que no han sido precipitadas por el ácido. Este medio se utiliza principalmente en la identificación de los estafilococos, pero también puede usarse para la detección de la actividad DNAsa en otros microorganismos. El agar Almidón se basa en la hidrólisis de amilasa, que lo degrada a maltosa y glucosa, empleados por la bacteria como fuente de carbono y energía; el almidón reacciona químicamente con yodo (lugol) para producir una tonalidad azul oscura cuando las moléculas se insertan entre las moléculas espiraladas del almidón, coloración que no se observa si la molécula está degradada, por lo cual la ausencia de color se asocia con la hidrólisis de almidón.

La hidrólisis de caseína (proteína de la leche) le permite al microorganismo obtener carbono y energía a partir de los aminoácidos que la conformaban; al mezclar la leche con un medio de cultivo la caseína forma complejos coloidales insolubles con el calcio, pero al ser degradada se recupera la transparencia inicial alrededor de la colonia. Con relación a los resultados observados en los agares, son subjetivos y dependen de la percepción de color del investigador, por lo cual se pueden presentar errores en la interpretación de los resultados, como lo ocurrido en el agar de almidón del Staphylococcus aureus generando una conclusión equivocada. De acuerdo a los datos experimentales de cada microorganismo (Tabla 1), tanto S. marcensis como S. aureus producen DNAsa, pese a que el primero es bacilo Gram negativo, el segundo es coco Gram positivo y el B. subtilis es bacilo Gram positivo, por lo cual este procedimiento no es útil para diferenciación Gram, aunque debe tenerse en cuenta que actividad por exoenzimas en Gram positivas en Gram negativas puede ocurrir a nivel del periplasma. La mayoría de exoenzimas que digieren macromoléculas insolubles están mediadas por represión por catabolito son inducibles, es decir, la presencia de sustratos más eficaz a nivel metabólico inhibe la enzima pero su síntesis se desencadena por los productos de la hidrólisis que pueden ingresar a la bacteria, por ejemplo, la síntesis de enzimas extracelulares y del ciclo de Krebs en B. subtilis está mediada por represión metabólica por glucosa, cuya transcripción se induce durante el proceso de esporulación para obtener la energía y los intermediarios necesarios para que ésta se lleva a cabo. CUESTIONARIO 7 1. ¿Cómo se clasifican los organismos como eubacterias y archeobacterias de acuerdo a su metabolismo? Dependen de materia orgánica externa (carbohidratos, Heterótrofas lípidos, proteínas) para obtener su energía y moléculas estructurales Fuente de Sintetizan sustancias esenciales a partir de materia Carbono inorgánica: para obtener energía fotolitoautótrofos, Autótrofas quimiolitotróficos (oxidación de anhídrido sulfuroso o compuestos ferrosos) Cianobacterias (oxifotobacterias) fotosíntesis oxigénica Bacterias púrpuras tienen bacterioclorofila a o b y Fotótrofas carotenoides Bacterias verdes con fotosíntesis anoxigénica Fuente de energía Crecen en medios estrictamente minerales sin luz, obteniendo ATP (poder reductor) en la respiración de un Quimiótrofas sustrato con H2S, S, S2O3, H2, NH3, NO2- o Fe2+ y utilizando CO2 como fuente de C Necesitan donadores inorgánicos de electrones: hidrógeno, Litótrofas CO, NH3, Fe2+ y otros iones de metales reducidos, así como Donadores de varios compuestos de S reducidos electrones Requieren como donadores de electrones, compuestos Organótrofas orgánicos Tabla 2. Clasificación de procariotas según su metabolismo

Fig. 4 Resumen de clasificación de procariotas

2. ¿Cómo define un medio de cultivo simple y uno compuesto? Es un medio empleado para aislamiento de microorganismos comunes y poco exigentes a nivel nutritivo como el Agar nutritivo; para microrganismos cuyas necesidades metabólicas sean más exigentes se emplean medios diferenciales y/o selectivos. 3. ¿Qué son las enzimas constitutivas e inducibles? Enzima constitutiva es aquella que la célula sintetiza constantemente con o sin sustrato y se encuentra en niveles basales (enzimas de glicólisis); las enzimas inducibles generalmente son sintetizadas como respuesta a la presencia del sustrato (inductor) como la lactosa es inductora de la β-galactosidasa. 4. ¿En qué consisten los mecanismos de represión enzimática? Las enzimas que catalizan la síntesis de un producto específico no se sintetizan si dicha sustancia está presente en el medio. La represión enzimática es un mecanismo muy extendido en bacterias que ocurre durante la síntesis de una amplia variedad de enzimas que intervienen en la síntesis de aminoácidos y bases nitrogenadas, en los cuales el producto inhibe la enzima de la vía de síntesis, controlando de manera efectiva las síntesis innecesarias. 5. ¿En qué consisten los mecanismos de inhibición enzimática? Fenómeno complementario a la represión en el cual la síntesis de una enzima sólo se lleva acabo cuando está presente el sustrato. Las enzimas que participan en la degradación de las fuentes de carbono y energía frecuentemente son inducibles. Estas sustancias que generalmente son moléculas pequeñas, se denominan colectivamente como efectores. No todos los inductores y correpresores son sustratos de las enzimas involucradas (Tiometilgalactósido (TMG) inductor de la ß-galactosidasa). La represión o la inducción enzimática actúan a nivel de la transcripción; la síntesis de enzimas está controlada por la

producción de RNAm, por lo cual, cuando un inductor se añade, se inicia la síntesis de RNAm que codifica para la enzima en particular; cuando una sustancia (correpresor), que causa la represión de la enzima se añade, causa la inhibición de la formación de RNAm. 6. ¿Cuáles son los mecanismos por los cuales se sintetizan macromoléculas transmisoras de información genética? El control génico se lleva a cabo mediante la inducción y represión enzimáticas. Los correpresores se unen al represor formando un complejo activo capaz de actuar sobre el gen operador y bloquear la síntess del RNAm o unirse al inductor y formar un complejo inactivo que no puede unirse al gen operador llevando a cabo la síntesis de RNAm. La secuencia de aminoácidos está determinada por los genes estructurales y la velocidad de síntesis de genes reguladores. Operón es la zona del DNA que constituye una unidad de expresión génica compuesto por varios genes y por secuencias promotoras y reguladoras que comparten. Al añadir inductores (lactosa) se incrementa la velocidad de síntesis de β-galactosidasa, βgalactósido permeasa y tiogalactósido transcetilasa, cuyos genes se representan como z, y, a y la velocidad de síntesis como i, p, o. Tanto la represión como la inducción representan sistemas de control negativo, ya que la síntesis de enzima solo puede tener lugar cuando el represor se separa del operador. Tiene un control positivo cuando se requiere una asociación entre una proteína y una parte de la región regulatoria de un operón, para la expresión de genes estructurales asociados. CONCLUSIONES  Serratia marcensis degrada DNA y proteínas como caseína  Bacillus subtilis produce exoenzimas que hidrolizan carbohidratos y proteínas (almidón y caseína, respectivamente)  Staphylococcus aureus sintetiza DNAsa y proteasa para obtener aminoácidos, carbono y energía  Se debe tener en cuenta la maquinaria enzimática asociada a un microorganismo para su identificación, complementando la información obtenida en una batería bioquímica, medios de cultivo diferenciales/selectivos, entre otros procesos. BIBLIOGRAFÍA 1. Brock Madigan, Biología de los Microorganismos, 8va edición, Prentice Hall, Madrid, 1999, págs. 118-121. 2. Regulación síntesis proteínas, http://roberto-raul.tripod.com/n.html. Consultado 27.10.13 3. Wolinowska, R., Ceglowski, P., Kok, J., & Venema, G. (1991). Isolation, sequence and expression in Escherichia coli, Bacillus subtilis and Lactococcus lactis of theDNase (streptodornase)-encoding gene from Streptococcus equisimilis H46A. Pubmed, 106(1):115-9 4. Tortora GJ, Funke BR, Case CL, Introducción a la Microbiología, 9ª edición, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina, 2007, págs. 143-46. 5. Olivas E, Alarcón LR, Manual de prácticas de Microbiología básica y Microbiología de alimentos, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, Instituto de Ciencias Biomédicas, Academia de Microbiología y Parasitología, Departamento de Ciencias Básicas, Programa de Nutrición, México, 2004, págs. 35-6. 6. Espinosa de los Monteros JJ, Caracterización del proceso de crecimiento de Bacillus subtilis bajo condiciones anaerobias, Universidad Autónoma de México, Instituto de Biotecnología, Cuernavaca, México, 2005, pág. 20

RESULTADOS (Práctica 8) Se realizaron siembras en cuatro medios de cultivo diferentes: agar MRS, MM1, MM2 y MM3 a partir de cultivos patrón de Escherichia coli y Lactobacillus sp, observando crecimiento de cultivos según siguientes las imágenes. Fig. 5 Cultivo en MRS

Fig. 6 Cultivo en MM1

Fig. 7 Cultivo en MM2

Fig. 8 Cultivo en MM3

Los datos de crecimiento de cultivos se recopilan en la siguiente tabla. Evaluación del crecimiento en agar MRS MM1 MM2 MM3

Lactobacillus sp + -

E. coli + + +

Tabla 3. Crecimiento de Lactobacillus sp y E. coli

ANÁLISIS DE RESULTADOS Teniendo en cuenta que los Lactobacillus son bacilos Gram positivos anaerobios facultativos o anaerobios estrictos y que E. coli son bacilos Gram negativos aerobios, básicamente se esperarían comportamientos muy diferentes en cada medio de cultivo dados por las necesidades nutricionales de cada especie. Según esto, el medio MRS siendo selectivo para lactobacilos, asegura todas las condiciones requeridas para su crecimiento, especialmente cofactores iónicos como magnesio y manganeso que además de asegurar la aerotolerancia durante la fermentación homoláctica, inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas mediante el citrato de amonio y el polisorbato 80, que además de suministrar derivados de ácidos grasos necesarios para los lactobacilos, inhibía selectivamente bacterias Gram negativas, razón por la cual no se observó ninguna colonia de Escherichia coli en el medio. Con respecto a los medios mínimos MM1, MM2 y MM3 cuya composición sólo se diferencia por el amonio, nitrato y metilamina (crece en metilamina, metaboliza N y lo libera) respectivos, se esperaba mayor contraste en el desarrollo de las colonias en los tres cultivos principalmente por la presencia de nitratos en el agar MM2, ya que la Escherichia coli es positivo para la reducción de nitratos debido a la producción de nitrato reductasa, pero eso se debe a que el inóculo no era del mismo tamaño, por lo cual el crecimiento no podía ser proporcional. Lactobacillus no reducen nitratos y debido a su alta complejidad nutricional y a la necesidad de factores de crecimiento especiales y específicos, no ocurre el crecimiento de colonias en ninguno de los medios mínimos, igualmente el crecimiento óptimo no se alcanza en pH neutros ni alcalinos, ya que todas las condiciones favorecen el crecimiento selectivo de E. coli. Por otra parte, E. coli en presencia de sustrato incrementa hasta mil veces la hidrólisis por activación de la enzima, indicando claramente que es un sistema inducible por el operón

lactosa (operón lac), similar al proceso catabólico en Lactobacillus sp; dicho operón es regulado disponibilidad de glucosa y lactosa en los medio de cultivo (Fig. 9)

Fig. 9 Control positivo y negativo de la transcripción del operón lac

CUESTIONARIO 8 1. ¿De acuerdo con los resultados obtenidos, qué significa un microorganismo altamente eficiente metabólicamente? Las bacterias son metabólicamente eficientes ya que la mayoría de sus enzimas son inducidas, por lo cual ningún intermediario es sintetizado en exceso o sin necesidad. 2. ¿Cuáles son las rutas centrales del metabolismo bacteriano? Las rutas anabólicas y catabólicas: síntesis de macromoléculas necesarias para la célula como proteínas, lípidos, polisacáridos y ácidos nucleicos a partir de los nutrientes del medio de cultivo que sea capaz de digerir y reutilizar en sí misma; degradación de macromoléculas para obtener energía necesaria para todos sus procesos vitales como crecimiento, respiración, reproducción, motilidad, entre otros. 3. ¿Cómo se define un compuesto intermediario del metabolismo? Es una molécula orgánica que permite el traslado de grupos químicos funcionales entre reacciones (coenzimas). Cada tipo de transferencia de un grupo es llevada a cabo por una coenzima particular, que es el sustrato para un grupo de enzimas que lo producen, y un grupo de enzimas que lo requieren, y por lo tanto son continuamente sintetizadas, consumidas y luego recicladas; generalmente son derivados de vitaminas y entre ellas se encuentran el ATP y el NAD.

4. ¿Cuándo una ruta metabólica se considera biosintética y catabólica de manera simultánea? Una ruta se considera anfibólica cuando participa en procesos de degradación y síntesis de macromoléculas al mismo tiempo, es decir, cuando los metabolitos de una vía son sustratos de otras rutas y así mismo, los productos de esas otras rutas participan en la vía inicial, como en el caso del Ciclo de Krebs, dependiendo de las reacciones anapleróticas para mantener cantidades adecuadas de los intermediarios para que la ruta anfibólica se lleve a cabo adecuadamente. BIBLIOGRAFÍA 1. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaüer MA, Microbiología Médica, Elsevier Inc, Madrid, España, 2006, pág. 420. 2. ATCC Medium: 2 Marine Agar / Broth 2216. Consultado 27.10.13. http://www.atcc.org/~/media/B5025AB990724A91B4491C391E054448.ashx 3. Samaniego LM, Sosa del Castillo M, Lactobacillus spp: Importantes promotores e actividad probiótica, antimicrobiana y bioconservadora, Reseña. Universidad de Matanzas, Facultad de Agronomía, Centro de Estudios Biotecnológicos, Matanzas, Cuba ,1998.