Normas E Rotinas Operacionais Do s4a4h

NORMAS E ROTINAS OPERACIONAIS DO LABORATORIO DE ÁNALISES CLÍNICAS

Setor de Coleta e Recepção Procedimento Operacionais Padrões (POP) 1. CADASTRO E INFORMAÇÕES 1.1 Identificar o paciente A chegar à recepção do laboratório, o paciente devera estar portanto requisição medica com os exames solicitados pelo seu medico, a recepcionista então irá cadastra-lo, dando ênfase ao nome, idade, sexo, endereço e/ou telefone. O cadastro do paciente acompanha a identificação numérico controle do laboratório. 1.2 Identificação de amostra Cada cadastrado possui um numero de identificação, utilizando para etiquetas os recipientes de coleta. É importante identificar sempre a parte lateral do frasco, e nunca a tampa, principalmente em frascos de urina e fezes para evitar trocas de material. 1.3 Identificações dos exames a serem realizados No laboratório as amostras são registradas em fichas internas de seus respectivos setores, nestas fichas constam a identificação numérica, o nome e a idade do paciente; em seguida as amostras e as fichas serão encaminhadas para os devidos setores. 1.4 Informações ao paciente Na recepção do laboratório o paciente irá receber as instruções de como deve proceder para coleta das amostras. Para dosagem bioquímica é o paciente é orientado sobre o período de jejum, sendo também necessário o conhecimento dos medicamentos que o paciente possivelmente esteja tomando. Quando a coleta de sangue, orienta-se o paciente quanto ao esforço fisico, o paciente deve vir ao laboratório totalmente descansado para evitar qualquer alterações nos resultados de seus exames.

2 COLETA DE SANGUE O sangue colhido com o objetivo de estudar as freqüências alterações dos seus componentes quando o organismo é acometido pôr doenças. No laboratório são executados exames de vários paciente ao mesmo tempo, torna-se imprescindível que uma sistematização bem organizada de trabalho seja seguida, evitando-se os erros de um modo geral, a perda de tempo e, especialmente, a troca dos resultados. Cuidados técnicos e de assepsia são também necessários a fim de evitar a contaminação do paciente, do operador e do sangue colhido. A coleta é feita de preferencia pela manha, com o paciente em jejum. Muitos são os meios para obtenção do sangue usado para o exame hematológico, como pôr exemplo, sangue o veneno, capilar, arterial, punção da medula óssea de ossos como o externo, tíbia, ilíaco e usado na maioria das vezes o venoso e o capilar. 2.1 Sangue Venoso A sua obtenção é feita pela função das veias mais íveis. As que são mais facilmente funcionadas localizam-se nas regiões do antebraço (veia mediana, cefálica e basílica), do pescoço (jugulares internas e externas) e inguinais (femural). Na criança, também se realiza na região da fontanela frontal (seio longitudinal). A veia é a preferida nos exames rotineiros, pois apresenta freqüentemente bom calibre e sua função é pouco dolorosa. Antes da punção, avalia-se a orientação do vaso pela visualização ou pela palpação digital e fazer a agulha penetrar e aprofundar nessa direção. 2.2 Sangue capilar É freqüente usado em crianças quando se empregam micrometodos ou em adultos para alguns exames como estudos de plaquetas, citologia e citoquimica celular. A coleta se faz após punção da polpa digital dos dedos ou dos grandes artelho, na criança. Pode-se ainda utilizar a regiões laterais do calcanhar, nos recem nascidos.

3. RECEPÇÃO AO PACIENTE O paciente é recebido com cortesia e cordialidade; explicando os procedimentos aos quais ele vai ser submetido, de modo a transmitir-lhe tranqüilidade e segurança. A coleta chama o paciente para a coleta de sangue, e de acordo com seu cadastro, confirma o nome, a idade e os exames a sem realizados pelo paciente. A mesma separa e identifica, na frente do paciente os tubos que serão utilizados para o material. 3.1 Condições para a coleta •Sala bem iluminada e ventilada; •Pia; •Cadeira reta com bracadeira regulável ou maca; •Garrote; •Algodão hidrófilo; •Álcool etílico a 70% ou álcool iodado a 1%; •Agulhas e lancetas descartáveis; •Sistemas a vácuo: e, tubo e agulhas descartáveis; •Tubo de ensaio com tampa; •Etiquetas para identificação de amostras; •Caneta; •Caixa descarpack; •Jaleco e mascara; •Luvas descartáveis; •Estantes para tubos. 3.2 Identificação da amostra Identificam-se os tubos para colocação da amostra. Escreva na etiqueta os dados do paciente: nome, numero do registro, data da coleta. 3.3 Tecnica para Coleta de Amostra do Sangue Venoso

•Coloca-se a agulha na seringa sem retirar a capa protetora. Não tocando na parte inferior da agulha; •Movimenta o embolo e pressione-o para retirar o ar; •Ajusta o garrote e escolha a veia; •Faz a anti-sepsia do local da coleta com algodão umedecido em álcool a 70% ou álcool iodatdo a 1%. Não tocando mais o local desinfetado; •Retira a capa da agulha e faz a punção; •

Introduz a agulha na veia mediana, basilica ou cefálica, atingida a veia, aspira o

sangue; •

Coleta-se aproximadamente 10 ml de sangue. Em crianças coleta 2 A 5 ML;

•

Retira o garote e em seguida a agulha;

•

Comprime o local puncionado com algodão embebido em álcool;

•

Retira a agulha da seringa e transfere o sangue para os tubos, quando for

transferido para um tubo contendo anticoagulante. Agita suavemente para facilitar a mistura do sangue como anticoagulante; •

Ao transferir o sangue para um tubo de ensaio sem anticoagulante. Escorrer

delicadamente o sangue pela parede do tubo. Este procedimento evita a hemolise da amostra. Descarta as agulhas e seringas nas caixas de descarpack; •

Orienta o paciente a pressionar com algodão a parte puncionada, mantendo o

braço estendido, sem dobrá-lo; 3.4Tecnica para coleta de amostra do sangue capilar Faz assepsia da poupa digital com álcool iodado. •

Deixar secar.

•

Puncionar com lanceta ou agulha descartavel, desprezando-se a primeira gota

de sangue e absorvendo-a com papel de filtro ou algodão seco; •

Sangue deve fluir espontaneamente, exercendo-se leve pressão somente

quando necessário; •

Direciona o tubo de capilar na gota para que o sangue flua pós capilaridade;

•

Limpar o dedo com algodão e aplicar anti-séptico.

Anticoagulantes. •

O sangue é coletado com a proporção correta de Anticoagulantes utilizados.

•

EDTA; 1 a 2 mg para cada ml de sangue.

•

Heparina; 1 gota (5.000 U/ml) para cada ml de sangue.

•

Oxalato de K; 1 a 2 mg para cada ml de sangue.

•

Citrato de sódio; 0,5 ml para 4,5 ml de sangue.

3.6 Biossegurança na coleta Todo cuidado é pouco na manipulação de materiais biológicos, tais como soro, sangue, secreções, fluidos orgânicos, tecidos, etc. Redobra-se as precauções, pois esses materiais são potencialmente infectantes e muitas vezes estão contaminados com agentes estiologicos diferentes do que se esta pesquisando, ou ainda desconhecidos. Usa-se sempre Equipamento de Proteção Individual (EPI): jaleco longo de mangas compridas e punho retratil, luvas descartáveis evita a formação e dispersões de aerossóis são micro partículas solidas e liquidas com dimensões aproximadas entre 0,1 e 0,5 micra que podem, no caso de conter microorganismos, permanecer em suspensão e plenamente viáveis pôr varias horas. Jamais reencapa-se agulhas. Esse procedimento é uma das principais causas da contaminação de profissionais de saúde por microorganismos, existentes no sangue e em outros fluidos orgânicos, como por exemplo, o vírus da Hepatite B e o HIV. Após a coleta é descartado esse material diretamente em caixas descarpack. Reduz ao máximo o manuseio de resíduos, em especial os pefurocortantes. Descarta o rejeito perfurocortante diretamente em caixas descarpack. 4. EMISSAO DOS LAUDOS DOS EXAMES LABORATORIAIS Os laudos estão disponíveis no prazo acertado com o paciente, se por algum motivo isto não for possível, há uma justificativa e, sempre que possível, o paciente é informado no mais curto prazo possível.

Em caso de laudo que possa oferecer perigo iminente à vida do paciente, o laboratório informa ao médico assistente e/ou ao responsável pelo paciente. O laudo é datado e assinado por profissional legalmente habilitado com o seu nome completo e legível, e o número do registro no conselho profissional. 4.1 Exames •Nome do exame; •Material utilizado; •Método; •Intervalo de referencia com as respectivas unidades e valores de alerta; •Informações necessárias à interpretação dos resultados, quando indicada; •Conclusões, quando indicadas. EXAMES DE SANGUE Acido urico Capac. Total de lig. do ferro Albumina Cetonemia Colesterol fracionado: •

HDL

•

LDL

•

VLDL

Aldolase Cloretos Ferro – colher pela amanhã Amilase Creatinina Triglicérides Bilirrubinas Eletroforese de proteínas

Uréia Cálcio Fosfatase acida Colesterol ( sem fracionamento) Fosfatase alcalina K total Fósforo CK – MB Frutosamina Gama GT Glicose Hemoglobina glicosilada Lipase Potássio Magnésio Sódio Mucoproteinas Transaminases: TGO/AST; TGP/ALT Velocidade de hemossedimentação (VHS) Hemograma Curva de fragilidade osmotica Plaquetas Tempo de protrombina Tempo de tromboplastina parcial ativada – PTTa Reticulocitos Eletroforese de hemoglobina Pesquisa de drepanócitos Alfa 1 Glicoproteína acida Fator reumatoide Grupo sangüíneo e fator Rh VDRL

Proteínas C reativa Anti HBs Anticorpos antireoidianos: -

antireoglobulina

-

antimicrossomal

Antiestreptolisina O •

- Monoteste

•

- Paul Bunnell Davidsohn

•

- Epstein Baar (IFI ou ELISA)

•

- Anti VCA – IgG e/ou IgM

Fan HbeAg Toxoplasmose IgG/IgM - ELISA - IFI – HAI HbsAg (Antigeno australia) Chagas (T. Cruzii): - IFI – HAI – ELISA HAV IgG/ IgM Anti Hbe Citomegalovírus IgG/IgM HIV 1 e 2 EXAMES DE URINA ROTINA 1)

Entrega ao paciente um frasco etiquetado com o número de registro do mesmo.

2)

Da as seguintes instruções ao paciente:

2.1 - Colher a primeira urina da manhã 2.2 -

Antes de colher a urian, fazer um asseio com água e sabão na genitália

externa. 2.3 – Desprezar as primeiras porções da urina e colher o restante no frasco coletor recebido do Laborátorio. 2.4 -

Trazer imediatamente para o Laboratorio dentro do laboratório dentro do

horário previsto para recebimento de material ( 7:30 às 10:00 hs, manhã ). Obs: Paciente Os sexo feminino não devem colher urina no período menstrual.

3) - Paciente feminino não deve coletar a urina no dia em que fizer Exame de Conteúdo vaginal, pois a paciente deverá estar sem asseio e para a coleta de urina terá que assia-se antes. EXAMES PARASITOLÓGICO FEZES 1)

Entrega ao paciente um frasco etiquetado com o numero de registro do

mesmo. 2)

Colher o material e trazer para o Laboratorio no horário estipulado

( 7:30 às 10:00 hs). 3)

Se houver dificuldade de colher o material pela manha no dia do exame

marcado, pode colher na véspera e colocar na geladeira o frasco coletor. EXAMES DE SECREÇÃO VAGINAL E SECREÇÃO URETRAL 1)

Se a paciente também tiver que realizar exame de URINA, o exame de

Secreção devera ser realizado no outro dia. 2)

Para fazer exame de Secreção Vaginal a paciente deve vir ao

Laboratorio sem tomar banho ou sem realizar qualquer tipo de asseio. 3)

Não manter relação sexual 24 hs antes da realização do exame,

abstinência sexual de 24 hs. 5. ENTREGA DE RESULTADO 1)

Os exames de paciente particulares e SUS ficam no arquivo colocados

em ordem alfabética. 2)

Os exames de paciente atendidos pelo hospital são entregues ao mesmo

colocados no prontuário. 3)

Observa-se o nome completo, idade do paciente.

4)

Confere se o nome do paciente no exame com o nome que está na

requisição. 5)

Retira-se o resultado e entrega ao paciente

6. EXAMES INCOMPLETOS

1) O exame só será liberado quando o paciente trouxer o restante do material para complementar os tipos de exames que constam da requisição médica. 2) Solicitamos ao paciente que traga no máximo ate 48 hs. Após as analises efetuadas, o exame é liberado normalmente.

Setor de Lavagem e Esterilização PROCEDIMENTO OPERACIONAIS PADRÔES (POP) A importancia de uma boa descontaminação de materiais (ESTERILIZAÇÃO) é peça imprescindível para um melhor desempenho dos trabalhos a serem executados em um laboratório de analises clinicas. O processo de esterilização o começo de tudo, sem a mesma os resultados não serão satisfatorios. Faremos uma descrição dos métodos que são utilizados para a esetrilização dos materiais do laboratorio. 1 OBJETIVOS 1.1 Gerais Tomar conhecimento dos cuidados na manipulação de materiais contaminados. Devemos tambem ter o conhecimeto de lavagem, secagem empacotamento e esterilização de materiais reaproveitaveis. 1.2 Especificos Uns dos objetivos mais importantes, é o conhecimento de como se deve usar as maquinas, como: AUTOCLAVE, ESTUFA DE SECAGEM E ESTERILIZAÇÃO E TAMBÉM O DEIONIZADOR. 2. EQUIPAMENTO B´SICOS •Autoclave •Estufa de secagem •Estufa de esterilização •Deionizador OBS: Há de se destacar também os materiais usados no processo de lavagem. São estes: •

Sabao

•

Hipoclorito 1%

3 METODO PARA ESTERILIZAR MATERIAIS:

1. O 1º o é colocar o material contaminado (coágulos e urina) são colocados em frascos plásticos contendo hipoclorito a 1%, pôr duas horas vida média do hipoclorito. 2. 2º o os materiais reutilizáveis ex: vidrarias são colocados no hipoclorito a 1% pôr 30 minutos, 3. 3º o sabão dextran pôr mais 30 minutos, 4. 4º o lava-se em água corrente pôr 30 minutos, 5. 5º o mais 30 minutos de molho em água deionizada, 6. 6º o são colocados na estufa de secagem.  Matérias da microbiologia 1. Os materiais contaminados são colocados na autoclave pôr 45 minutos à 121ºC 2. Depois que sair do autoclave, devemos seguir os mesmos os a partir do 3º descrito acima; 3. Após a secagem, leva o material para o balcão de empacotamento e lá, definitivamente separado. Ex: plástico, vidro, etc. 4. Depois de separado, o material é colocado na estufa de auto precisão para esterilização com fita teste. Deve-se salientar que materiais plásticos não devem ir para a estufa de esterilização, pois a mesma os danificará, devido sua alta temperatura que gira em torno de 180ºC. O temo que o material deve ficar na estufa de esterilização é de 2 hs. E com relação ao material plástico este e embalado e colocado na autoclave de 15 a 20 minutos. OBS: Para identificarmos um material autoclavado devemos verificar a fita teste, esta deve estar com listras queimadas. Com todos esses os, nós faremos uma boa esterilização, pois a mesma os danificará, devido sua alta temperatura que girar em torno de 180ºC. O tempo que o material deve ficar na estufa de esterilização é de 2 hs. E com relação ao material plástico este e embalado e colocado na autoclave de 15 a 20 minutos.

É importante compreender a importancia da esterilização em todo o processo de trabalho em Laboratorio, bem como o uso de equipamentos essenciais (AUTOCLAVE, ESTUFA DE ESTERILIZAÇÃO E SECAGEM E DEIONIZADOR), e procedimentos de lavagem e descontaminação de materiais. 4. DESCARTE DE MATERIAL CONTAMINADO Deve haver POP para o descarte de material contaminado gerado no laboratorio, que são aqueles despejos em estado sólido, semi-solido, liquido ou pastoso, apresentando características de toxidade e/ou atividade biologica, que podem afetar direta ou indiretamente os seres vivos ou causar contaminação das aguas, do ar e do solo. Procedimento para com os materiais. •

Agulhas (e capilares de hematócrito): Uma vez terminada a coleta do

sangue-amostra são desprezadas em caixas descarpack •

Seringas: Após o termino da coleta do material, tambem são descartaveis em

caixas escarpack. •

Algodao, gaze, papeis e material afins: Apos o uso devem ser descartados

em sacos de lixo branco e reforçados para posterior coleta pôr serviço especializados. •

Swabs, especulos, espatulas, abaixadores de lingua, etc.: Proceder da

forma descrita acima. •

Urina: Acrescentar uma parte de solução de hipoclotito de sodio a 1%. Deixa

em contatoo pôr 2 horas descarta no esgoto sanitario. Os frascos devem ser descaratados em sacos de lixo brancos reforçados para posterior coleta pôr serviços especializados. •

Fezes: descarta em saco de lixo reforçados.

•

Sangue, coagulos e semelhantes: colocar todo o sangue e seus derivados

em um recipiente de plastico resistente. Adicionar solução de hipoclorito de sódio. Deixar em contato pôr 2 horas. Devido à decomposição do hipoclorito em contato com o sangue, deve-se adicionar mais hipoclorito, até não haver qualquer formação de espuma. •

Meios de cultura e despejos e bactriologicos: Dispensa o material o, a

esterilização em autoclave e descartar em lixo especial.

•

Lâminas e lamínulas: Não são descartas. Ao recuperá-las são submetidas a

um tratamento hipoclorito de sódio a 1% pôr 30 minutos. Apos o processo, proceder a lavagem e recuperação.

PROCEDIMENTO DE ROTINA HEMATOLOGIA MANUAL

HEMATOLOGIA A hematologia compreende o estudo das celulas sanguineas e coagulação. Normalmente, os constituintes do sangue (hemacias, leucócitos e plaquetas) permanecem em equilibrio sempre constante devido ao sistema hematopoiético, com função de formação hemolítica ou de destruição das células sanguineas. (O. LIMA, 1992) OBJETIVOS O estudo no Laboratório de hematologia consiste em analisar células sanguineas e a coagulação atraves de exames hematológicos, podendo assim qualificar e diferenciar as células sanguineas. Esses testes realizados possibiltam um diagnostico mais conclusivo, auxiliando clínico no tratamento de uma patologia pr deficiencia hematologica. HEMATÓCRITO Consiste em determinar em porcentagem a concentração de eritrócitos em dados volume de sangue não coagula. È a razão entr o voluem deeritrócitos em relação ao volume do sangue total. (O. LIMA, 1992)

•

MATERIAIS E MÉTODOS

-

Tubo capilar

-

Bico de bunsen

-

Centrífuga para microhematócrito

-

Tabela para microhematócrito

•

O tubo de microhematócrito é preenchido por capilaridade até ¾ da capacidade do

capilar. A extremidade vaziaé vedada pela chama do bico de bunsen. Colocar os capilares na centrifuga para microhemat´crito, com o cuidado de coloca a parte aberta contra o apoio de borracha para evitar quebras e extravasamentos. A ponta selada fica voltada para fora. É recomendável um centrifugação a 3.000 RPM/5 minutos. Após a centrifugação, o tubo apresenta uma coluna de sangue, incluindo o plasma e uma coluna de eritrócitos. Devem ser medidos com o auxílio da tabela. HEMOGLOBINA (Hb) É o principal componente dos eritrócitos. É um conjugado de proteínas que serve como transporte de O2 e CO2. (O. LIMA, 1992) •

MATERIAIS E MÉTODOS

-

Tubos para centrífuga

-

Padrão (HiCN – Cianetohemoglobina)

-

Reagente de Drabkin

•

Tomar 3 tubos e proceder da seguinte maneira:

Padrão Amostra Reag. de Drabkin

B 5.0uL

P 20uL 5.0uL

A 20 uL 5.0uL

Hogenizar. Descansar em temperatura ambiente por 5 minutos. Leitura a 540 nm no espectrfotômetro. Zerar com o Branco. ESFREGAÇO O exame de esfregaço sangüíneo é uma parte importante da avaliação hematológica. Para obter esfregaços satisfatório, é indispensável que se tome certas precauções: -

lâminas devem estar limpas e desengorduradas;

-

a gota de sangue não deve ser muito grande. Quanto maior a gota, mais espesso o esfregaço. O ideal é uma gota de 20uL;

-

O esfregaço deve ser feito rapidamente, antes que ocorre a coagulação. (O. LIMA, 1992)

•

MATERIAIS E MÉTODOS

-

Lâminas limpas e desengorduradas

-

Lâminas de extensão (extensora) •

Colocar uma gota de sangue no final de uma lâmina apoiada em uma superfície

plana. Com o polegar e o indicador, segura-se o final da lâmina de extensão contra a superfície da primeira lâminas. Empurra-se a lâmina de extensão a uma velocidade moderada para frente até que o sangue tenha sido espelhado em um esfregaço moderadamente delgado. As lâminas devem ser secas a temperatura ambiente e depois corada para análise ao microscópio. È conveniente confeccionar vários esfregaços ao mesmo tempo. Marcar sempre os esfregaços usando agulha ou lápis dermográfico com o nome do paciente e a data sobre a superfície do mesmo. COLORAÇÃO Os corantes de anilina usados em esfregaços sanguineos são de duas classes gerais: -

corantes básicos, como o azul de metileno;

-

corantes ácidos, como a eosina. O núcleo das células toma as cores básicas, como o azul de metileno, enquanto

que os corantes básicos agem sobre os elementos citoplasmáticos. Pertencem a este grupo os corantes de Romanowsky. Os derivados mais usados do corante primitivo de Romanowsky são: Giemsa. Leishman, Wrigth entre outros. Nesse setor foi usado o corante Leishman. (O. LIMA, 1992) •

MATERIAL E MÉTODOS

- e para lâminas - Corante de Leishman

Colocar a lamina sobre o e. Verter 20 gotas do corante sobre a lamina ou o suficiente para cobri-la. O álcool metilico (metanol) da solução corante fixa o esfregaço. Deixar corar durante 15-20 minutos. Lavar em água corrente e deixar secar. Observar ao microscópio com objetiva de imersão. CONTAGEM GLOBAL A contagem dos elementos morfológicos do sangue (eritrócitos, leucócitos e plaquetas deve ser efetuado pala manhã. Consiste em trabalhar com material aferido com a finalidade de determinar o número dos elementos morfológicos. Para isso, é necessário diluir volume conhecido de sangue com determinada quantidade de líquido diluidor. Conta-se as células na área reticulada da câmara destinada para cada tipo de células (ver Anexos) (O. LIMA, 1992) •

MATERIAL E MÉTODOS

-

Câmara de Contagem (Camara de Neubauer)

-

Líquidos diluidores (hayem, Turk, Oxalato de Amônia 1%)

-

Pipetas graduadas e automáticas

-

Lamínulas

Contagem Global de Leucócitos Valores de Referencia: 5.000 – 10.000 mm3 -

0.38 mL do líquido de Turk

-

20uL sangue

-

Diluição = 1/20

•

Depois de homogeneizar o líquido de Turk com o sangue, umedecer a câmara de

líquido de Turk com o sangue, baixo da lamínula, inserir com auxílio da pipeta

automática pequena quantidade da solução diluída. Cuidado para evitar presença de bolhas. Esperar 5 minutos a fim de que os glóbulos se depositem. Observar ao microscópio primeiramente com a objetiva de menor aumento e em seguida numa objetiva de 40X. Fazer a contagem nos quadrantes destinados a leucócitos. Contagem Global de Plaquetas Valores de Referêncisa: 150.000 – 400.000 mm3 -

0.38 mL oxalato de amôni 1%

-

20uL sangue

-

Diluição = 1:20

•

Depois de homogeneizar o oxalato de amônia 1% com o sangue, umedecer a

câmara de Neubauer e cobri-la com lamínula. Pôr baixo da lamínula, inserir com o auxilio da pipeta automática pequena quantidade da solução diluída. Cuidado para evitar presença de bolhas. Esperar 10 minutos a fim de que as plaquetas se depositem. Esperar em câmara úmida. Observar ao microscópio primeiramente com a objetiva de menor aumento e em seguida numa objetiva de 40X. Fazer a contagem nos quadrantes destinados a plaquetas, que são os mesmo para contagem de eritrócitos. VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO (VHS) É a velocidade com o qual os glóbulos vermelhos vão para o fundo do tubo. Os glóbulos vermelhos que sedimentam é porque a sua densidade é maior que a do plasma. A velocidade com que eles sedimentam é porque a sua densidade é maior que a do plasma. A velocidade com que eles sedimentam varia, direta ou indiretamente com vários fatores. (O. LIMA, 1992)

•

MATERIAIS E MÉTODOS

-

Tubo de Westergren

-

Estante de westergren

• O método de Westergren modificado produz os mesmos resultados que o método de Westergren original, mas emprega sangues naõ coagulado com EDTA ao invés de citrato. Isso permite que o VHS seja realizado com a mesma amostra de sangue que os outros estudos hematológicos.  2 mL de sangue com EDTA bem misturados são diluídos em 0.5 mL de cloreto de sódio a 0.85% ou 0.5 mL de citrato de sódio a 3.8%. Uma pipeta de Westergren é completada até a marca 0 (zero) e colocada exatamente na vertical na estante à temperatura ambientem, sem vibrações ou exposição direta à luz solar. Após exatamente 60 minutos, a distancia do topoo da coluna é registrda em molímetros como o valor da VHS. Se a demarcação entre o plasma e a coluna de células vermelhas é distinta, o nível é lido onde a densidade total aparece primeiro. Valores de Referência: Homens: 3-15 mm Mulheres: 3-20 mm Crianças: 3-12 mm

CÉLULAS LE (Lupus Eritematoso) Um anticorpo presente na fração globulina gama do soro dos pacientes de LES, o chamado fator “LE”, reage com a nucleoproteína dos núcleos dos leucócitos. O núcleo do fagócito acha-se comprimido na periferia da célula. A maior parte da região protoplasmática é ocupada pela massa nuclear transformada. O citoplasma reduz-se à estreita faixa na periferia do leucócitos. Na células “LE”, a estrutura da cromatina é substituída pôr massa arredondada, homogênea, de coloração púrpura, de tamanho variável, mas usualmente maior que a hemácia. O fagócito pode englobar mais de núcleo. (O. LIMA, 1992) MATERIAL E MÉTODOS -

Banho Maria a 37ºC

-

Toma-se o sangue sem anticoagulante e coloca-se em Banho Maria a 37ºC/2hs. Depois realiza-se o esfregaço e observa-se ao microscopio. Deve-se sempre realizar o exame FAN junto com o exame de células LE.

CONTAGEM DE RETICULÓCITOS Os reticulócitos são células vermelhas imaturas não nucleadas que contêm RNA e continuam a sintetizar hemoglobina após a perda do núcleo. O sangue incubado rapidamente em uma solução de azul cresil brilhante ou azul metileno. No RNA é precipitado como um complexo corante ribonucleoproteínas. O complexo aparece microscopicamente como uma rede azul escura ou grânulos azuis escuros que permitem a identificação e contagem de reticulócitos. (O. LIMA, 1992) MATERAIS E MÉTODOS -

Esfregaço sangüíneo

•

Conta-se o número de reticulócitos em 10 campos diferentes. O esfregaço é feito a partir de 100uL de sangue + 1 gota de azul cresil brilhante.

Valores de Referências: 0.5 - 2.0% 10 campos = total / 10 = número % COAGULOGRAMA Tempo de Sangria (TS) É o tempo necessario para a cessação da hemorragia, ocasionando por pequena incisão, de dimensão padronizada, praticada artificialmente. (O. LIMA, 1992) •

MATERIAL E MÉTODOS

-

Equipamento para punção digital

-

Papel de filtro

-

Cronômetro

•

Faz-se a assepsia da polpa digital ou do lóbulo da orelha com a lanceta, fazer a incisão e deixar o sangue fluir espontaneamente. Marcar no cronometro o início no momento do aparecimento da primeira gota. Com o papel de filtro absorver de 30 em 30 segundos a gota de sangue formada sem tocar a incisão. Quando cessar o

fluxo de sangue, parar o cronômetro. Quando cessar o fluxo de sangue, parar cronômetro. O intervalo decorrido entre o aparecimento da primeira e da ultima gota representa do tempo de sangria.

Valores de referência: 1 – 6 minutos Tempo de Protrombina Ativada (TAP) É a prova de escolha para investigação do sistema extrínseco da coagulação sangüínea. É uma prova de grande valor na demonstração de deficiência dos fatores de coagulação I, II, V, VII, X. (O. LIMA, 1992) •

MATERIAL E MÉTODOS

-

Plasma citratado do paciente

-

Solução de tromboplastina

-

Banho Maria a 37°C

-

Tubos de ensaio

-

Solução de cloreto de cálcio a 0.025M

•

Coloca-se 100uL do plasma citratado do paciente + 100uL da suspensão de tromboplastina no tubo de ensaio. Homogeneiza, adicionar rapidamente 100uL da solução de cloreto de cálcio. Neste instante, acionar o cronômetro. Retirar o tubo do BM e agitá-lo suavemente, de 2 em 2 segundos, até o aparecimento do coágulo, parando simultaneamente o cronômetro. O tempo consumido em segundos constitui o TAP. Valores de Referência: 11 – 13 segundos Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA)

É a melhor prova para investigar as alterações do mecanismo da coagulação sangüínea. Fatores que participam do sistema intrínseco estão envolvidos, com exceção das plaquetas e do fator XIII, bem como do fator VII, do sistema extrínseco. (O. LIMA, 1992) •

MATERIAL E MÉTODOS

-

Plasma citratado do paciente

-

Solução de tromboplastina parcial

-

Banho Maria a 37°C

-

Cronômetro

-

Tubos de ensaio

-

Solução de cloreto de cálcio a 0.025 M

•

Coloca-se 100uL de cefalina + 100uL plasma citratado do paciente. Homogeneiza e encuba em Banho Maria a 37°C/3 min. Após esse tempo, adicionar rapidamente 100uL da solução de cloreto de cálcio. Neste instante, acionar o cronômetro. Agitálo suavemente, de 5 em 5 segundos. Ao fim de 30 segundos, retirar o tubo do BM e agitá-lo

suavemente,

observando

o

aparecimento

do

coágulo,

parando

simultaneamente o cronômetro. O tempo consumido em segundos constitui o TTPA. Valores de Referência: 35 – 45 segundos CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS Consiste em determinar a proporção existente entre as distintas variedades de leucócitos. A contagem diferencial de leucócitos é dos mais valiosos métodos entre os exames citológicos do sangue. (O. LIMA, 1992) •

MATERIAL E MÉTODOS

-

Esfregaços corados

•

Deve-se observar a lâmina próximo à cauda o esfegaço onde quase não se encontra “roleaux” e facilita a contagem. Total de 100 células.

FIBRINOGÊNIO •

MATERIAIS E MÉTODOS

-

Tubo capilar

-

Plasma

-

Microcentrífuga

-

Tabela de Hct

-

Banho Maria a 56°

• Aspira-se o plasma no tubo capilar e encuba-se em Banho Maria a 56ºC/15 minutos. Leva-se à centrífuga para microhematócrito por 5 minutos / 3000 RPM. Faz-se a leitura na tabela para Hct e multiplica o resultado por 92. Valores de Referência: 200 – 400 mg/dL INDÍCES HEMATIMÉTRICOS VCM = Hct / Hem x 100 u3 HCM = Hb/ Hem x 100 pg CHCM = Hb / 100%

PROCEDIMENTO DE ROTINA SOROLOGIA MANUAL

SOROLOGIA O melhor diagnóstico de um processo infeccioso é a demonstração do patógeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos biológicos do hospedeiro. Nem sempre é possivel essa prática pela ausência do agente infeccioso ou pela pocua sensibilidade dos métodos ou por longos períodos exigidos para uma resposta laboratorial. Métodos parasitológicos ou microbiológicos são deficientes para diagnóstico de algumas

patologias.

São

utilizados

métodos

imunológicos,

sorológicos

ou

imunoensaios. São técnicas para a detecção e quantificação de Ag ou Ac, podendo utiliza-se de reagentes marcados ou não. Comumente são utilizados marcadores radiotaivos, enzimpaticos, fluorescentes e quimioluminescentes. Os testes sorológicos são feitos através de pesquisas de anticorpos pu antígenos, sendo a reação Ag – Ac, visualizada pôr alguns métodos como aglutinação, precipitação, floculação e outros. Esses testes de pesquisa de Ag – Ac desempenham uma importante função de diagnóstico laboratorial clínico como complemento de outros testes e provas, desde que sejam respeitadas suas indicações e limitações. OBJETIVO No setor de sorologia, o principal é demonstrar aos estagiários os princípios das técnicas mais usadas nos testes sorológicos, assim sua importância e identificação. A alta sensibilidade dos testes utilizados garante um importancia no setor de triagem sorológica para seleção de pacientes que podem vir a ser doadores e retores de orgãos, evitando transtornos pós-transfusionais. A Ciência Sorologia tem como principal objetivo pesquisar anticorpos específicos auxiliando, assim, no diagnóstico individual de determinadas patologias com também diferenciando as fases da doença.

 Imunodifusão Radial Simples -

Príncipio – Antígeno ou Anticorpo permanecem fixados ao e e o outro se difunde, até haver um halo de precipitação formado pôr reação de Ag com o Ac ao redor da inoculação.

- Materiais e Métodos – Toma-se uma placa com gel (ágar misturado com a diluição apropriada de Ag específico para Ac determinado) contendo orifícios onde, com ajuda da micropipeta, será adicionado 5uL do soro. Fecha a placa e guarda em forma invertida em câmara úmida, para que mantenha o meio úmida, pôr 48h a 72h. Valores de Referência: IgG: 710 – 1520 mg/dL IgM: 90 – 310 mg/dL AGLUTINAÇÃO A reação de aglutinação é caracterizada pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos em sua superfície. A aglutinação pode ocorrer tanto com particulas que apresentam determinadas antigênicos naturais em sua superfície (hemácias, bactérias, protozoários, etc.) como com partículas inertes (látex, poliestireno, etc.), ou mesmo com células antigenicamente não relacionadas (hemácias, bactérias) às quais se absorvem ou se fixam antígenos solúveis. As reações podem ser de aglutinação direta ou indireta. A) TESTE DA AGLUTINAÇÃO DIRETA -

Princípio – Aglutinação de partículas antigênicas insolúveis, em sua forma íntegra

ou fragmentada, na detecção de anticorpos específicos. Teste bastante utilizado para classificação sanguinea, mononucleose infecciosa e brucelose. - Materiais e Métodos –

 Bruceloso (Antígeno Rosa Bengala): é uma suspensão de bacilozs em coloração rosa, mistura o bacilo com amostras de pacientes e complexo Ag – Ac se aglutina.  Mononucleose: Toma-se uma placa de vidro e mistura-se uma gota do soro do paciente com o reagente que contém hemácias de cavalo (ag para mononucleose mais Ac heterófilos). Observa-se a presença de aglutinação. Como os anticorpos heterófilos, que não são específicos para o vírus Epstein-Barr, podem aglutinar as hemácias de cavalo, para o teste positivo realiza-se uma Segunda etapa. Nesta, mistura o soro com células renais de cobaia, as quais removam quase todos os anticorpos heterófilos da mononucleose infecciosa. B) TESTE DA AGLUTINAÇÃO INDIRETA - Princípio – As hemácias e as partículas inertes podem ser sensibilizadas por adsorsão iva, devida aos contatos direto com os Ag solúveis. São utilizados como es na adsorção de proteína solúvel e Ag polissacarídeos, funcionando como sistema indicador da reação Ag-Ac. AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX  PCR (Proteína C Reativa): reação de aglutinação em lâminas, a qual particulas de latex sensibilizadas com Ac anti-PCR estabilizadas são aglutinadas em presença da Proteína C Reativa. -

Materiais e Métodos a) Determinação Qualitativa: Numa lâmina de vidro, com àreas para diferentes

testes, depositar sucessivamente em 3 subdivisões, 1 gota de soro positivo, 1 gota de soro negativo e 1 soro do soro a testar. Adicionar a cada uma delas 1 gota do reativo látex anti-PCR. Homogeneizar. Fazer movimentos suaves de rotação procedendo a leitura após cinco minutos. b) Determinação Semi-Quantitativa: Em casode amostra positiva, realizar sucessivas diluição do soro até que se encontre a maior diluição que ainda fornece aglutinação. O procedimento da análise é o mesmo do teste qualitativo, porém, utiliza-

se as amostras diluídas. Sendo a sensibilidade do teste de 7UI/mL, o cálculo semi quantitativo é realizado da seguinte forma: [ ] = 7 x (maior diluição positiva)

 FR (Fator Reumatóide) - Materiais e Métodos – a) Determinação Qualitativa: Pipetar 1 gota do soro do paciente em uma área da lâmina e , sobre ela, 1 gota da suspensão de látex sensibilizado com IgG humana altamente purificada e estabilizada e suspensa em tampão glicina. Proceder da mesma forma com os soros controle positivo e negativo. Fazer movimentos suaves de rotação, sob uma boa fonte de luz, durante 2 minutos. Observar a formação de aglutinação. b) Determinação Semi-Quantitativa: Em caso de amostra positiva, realizar sucessivas diluições do soro até que se encontre a maior diluição positiva. O cálculo semi quantitativo é realizado da seguinte forma: [ ] = 25 x (maior diluição positiva)  ASLO (Anti-Estreptolisina O): Reação de aglutinação em lâminas, a qual partículas de látex sensibiladade com estreptolisina “O” estabilizada são aglutinadas em presença de anti-estreptolisina. O reativo é padronizado pôr comparação com o padrão da OMS. -

Materiais e Métodosa) Determinação Qualitativa: Numa lâmina de vidro, com áreas para diferentes

testes, depositar sucessivamente em 3 subdivisões, 1 gota de controle positivo, 1 gota de controle negativo e1 gota do soro a testar. Adicionar a cada uma delas 1 gota do latex sensibilidade com ASO. Homogeneizar. Fazer movimentos suaves de rotação. Proceder a leitura em exatamente 2 minutos. b) Determinação Semi-Quantitativa: Em caso de amostra positiva, a partir da diluição 1/20, realizar sucessivas diluições de razão 2 a té 2560 em tampão glicocola. O procedimento da análise diluídas. O título de Ac ASO é calculado da seguinte forma:

UI/mL = inverso da última diluição positiva x 10. HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA Hemácias estão entre os melhores es de Ag para os testes de aglutinação, pois uma serie de Ag que pode ser ligada à sua superfície para fornecer um sistema indicador sensível na detecção de Ac, porém, sua superfície é complexa, facilitando a ligação de muitos Ag e, frequentemente, acarreta a presença de Ac heterófilos que devem ser removidos antes da execução do teste.  CHAGAS - Princípio – Eritrócitos de aves estabilizados, sensibilizados com compontes antigênicos Trypanossoma cruzi altamente purificados, mostram aglutinação quando reagem com Ac contra esses antígenos presentes no soro do paciente. - Materiais e Métodos – a) Determinação Qualitativa: Colocar a placa sobre um pano úmido para neutralizar as forças eletrostáticas. Usar 1 cavidade da placa pôr amostra, incluindo sempre os controles positivo e negativo. Usar diluição do soro 1/32 com a solução diluente com os controles positivo e negativo. Transferir 25uL da suspensão homogênea de hemácias placa. Adicionar 25uL da suspensão homogênea de hemácias em cada cavidade. Agitar a placa pôr vibração mecânica pôr 4 minutos. Deixar em repouso por 1 a 2 horas à temperatura ambiente, em locar livre de vibrações. Fazer a leitura. Reação positiva como um tapete e reação negativa quando se depositam no fundo da cavidade formando um botão. b) Determinação Quantitativa: Em caso de amostra positiva, deve-se realizar sucessivas diluições (titulação) a partir da diluição do soro de 1/32. Pipetar 25uL da solução diluente com 2-Mercaptoetanol, a partir da Segunda cavidade da placa, até a diluição que se pretende estudar. Titular sempre deixando 25uL da diluição, desprezar os últimos 25uL. Pipetar 25uL da suspensão homogênea de hemácias em todas as cavidades. Agitar a placa pôr vibração mecânica por 4 minutos. Deixar em repouso pôr 1 a 2 horas à temperatura ambiente, em local livre de vibrações. Fazer a leitura.

 TOXOPLAMOSE - Princípio – Eritrócitos de aves estabilizados, sensibilizados com componentes antigênicos do Soxoplasma gonddi altamente purificados, mostram aglutinação quando reagem com Ac contra esses antígenos presentes no soro do paciente.

- Materiais e Métodos – a) Determinação Qualitativa: Colocar a placa sobre um pano úmido para neutralizar as forças eletrostáticas. Usar cavidade da placa por amostra, incluindo sempre os controles positivo e negativo. Usar diluição do soro 1/16 com a solução diluente com 2-Mercaptonol. Fazer o mesmo com os controles positivo e negativo. Transferir 25uL da diluição 1/16 de cada amostra e controles para as respectivas cavidades da placa. Adicionar 25uL da suspensão homogênea de hemácias em cada cavidade. Agitar a placa pôr vibração mecânica pôr 4 minutos. Deixar em repouso por 1 a 2 horas à temperatura ambiente, em local livre de vibrações. Fazer a leitura. Reação positiva quando as hemácias de depositam no fundo da cavidade como um tapete e reação negativa quando se depositam no fundo da cavidade formando um botão. b) Determinação Quantitativa: Em caso de amostra positiva, deve-se realizar sucessivas diluições (titulação) a partir da diluição do soro de 1/32. Pipetar 25uL da solução diluente com 2-Mercaptoetanol, a partir da Segunda cavidade da placa, até a diluição que se pretende estudar. Titular sempre deixando 25uL da diluição, desprezar os últimos 25uL. Pipetar 25uL da suspensão homogênea de hemácias em todas as cavidades. Agitar a placa por vibrações mecânicas pôr 4 minutos. Deixar em repouso pôr 1 a 2 horas à temperatura ambiente, em local livre de vibrações. Fazer a leitura.  FLOCULAÇÃO (VDRL) O teste de VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) emprega cristais de colesterol que são sensibilizados com cardiolipina para a pesquisa de Ac na sífilis. É classificado como um teste não treponêmico, usado como triagem ou controle da cura.

- Princípio – Reação imunológica de floculação utilizando antígeno de cardiopina, lecitina e colesterol em solução alcoólica, onde as partículas de Ag floculam ao entrar em contato com o soro ou plasma (reagina). - Materiais e Métodos – a) Determinação Qualitativa: Tem como objetivo a triagem e eliminação dos soros não reagentes. Para isso, toma-se uma placa de Kline com suas cavidades devidamente identificadas para cada reação. Pipetar 50uL da amostra a ser analisada e dos soros controle positivo e negativo. Adicionar-se 25uL da suspensão antigênica à cada cavidade, que irá reagir com os Ac presentes. Colocar lâmina em agitador mecânico pôr 4 minutos. Fazer leitura em microscópio com objetiva de 10x. b) Determinação Semi - Quantitativa: Tem como objetivo reduzir a pequenos intervalos a quantidade de Ac presentes na amostra. Para tanto, deverá ser feita diluição da amostra em solução salina. Proceder cada diluição do mesmo modo como no teste qualitativo. O título da amostra será o da última diluição onde ainda se visualiza a presença de agregados. UROANÁLISE Com a análise da urina, iniciou-se a medicina laboratorial. Foram encontrados hieróglifos egípcios com desenhos de médicos examinado frascos de urina em forma de bexiga. Muitas vezes, esses médicos nunca viam o paciente, apenas sua urina. Embora não contasse com os sofisticados métodos atuais, eram capazes de obter informações diagnósticas a partir de observações básicas como cor, turvação, odor, volume, viscosidade e até mesmo presença de açúcar, ao observarem que certas amostras atraíam formigas. É interessante notar que essas mesmas características urinárias ainda são relacionadas pêlos laboratórios hoje em dia. Contudo os modernos métodos de uroanálise ampliam seu campo de ação, abrangendo não só o exame físico mas também a análise bioquímica e o exame microscópico do sedimento urinário. (STRASINGER, 1998) Analisaremos também o LCR (Líquido Cefalorraquidiano). Trata-se de um sistema fisiológico destinado a distribuir nutrientes pelo tecido nervoso, retirar resíduos

metabólicos e servir de barreira mecânica para amortecimento dos traumatismos que porventura atinjam o encéfalo e a medula espinhal. (STRASINGER, 1998). Por fim, faremos também uma análise do líquido seminal. Com exceção da urina, é o líquido recebido com mais freqüência em laboratórios de análises clínicas. As duas principais razões para sua analise são avaliações de casos de infertilidade e do estado pós-vasectomia. (STRASINGER, 1998)

MATERIAIS E MÉTODOS •

COLETA (STRASINGER, 1998) URINA – A amostra deve ser colhida em recipiente limpo e seco.

Recomenda-se o uso de recipientes descartáveis por serem econômicos e pôr eliminarem a possibilidade de contaminação decorrente de lavagem incorreta. O recipiente de amostra deve ser devidamente etiquetado, contendo data e nome do paciente. As etiquetas devem ser postas sobre o recipiente e não sobre a tampa. A amostra deve ser entregue imediatamente ao laboratório e analisada dentro de uma hora. A amostra que não puder ser entregue ou analisada dentro desse tempo devera ser refrigerada ou receber conservante químico apropriado. LCR – O LCR é normalmente colhido por punção lombar entre L3 e L4 ou entre L4 e L5. As amostras geralmente são colhidas em tubos estéreis, marcados 1,2 e 3, na ordem em que são obtidos. O tubo 1 é usado par análises bioquímicas e sorológicas, o tubo 2 destina-se á contagem celular e o tubo 3 em geral é usado par a microbiologia, por ser o que menos probabilidade tem de conter células introduzidas acidentalmente pelo procedimento de punção espinhal. SÊMEN - Como a composição das frações do sêmen é variável, sua coleta deve ser bem feita para que a avaliação da fertilidade masculina seja precisa. Para isso, os pacientes devem ser bem orientados. As amostras devem ser colhidas em recipientes estéreis após três dias de abstinência sexual. Não é recomendável o uso de preservativos o uso de preservativos na coleta de amostras para os exames de fertilidade, pois podem conter substancias espermaticidas. Sempre que possível, a

amostra deve ser colhida em laboratório, mas se isso não for viável, deverá ser mantida em temperatura ambiente e entregue em até uma hora ao laboratório. Deverá ser anotada a hora da coleta e não do recebimento. • CONSERVAÇÃO (STRASINGER, 1998) URINA - O método de conservação mais utilizado é a refrigeração, capaz de evitar a decomposição bacteriana da urina pelo período de uma noite. É preciso deixar que a amostra volte à temperatura ambiente antes da análise química com fitas reativas. Existem várias conservantes químicos que podem ser utilizados, portanto é impossível escolher aquele que se ajuste melhor às necessidades da análise solicitada. LCR - Amostras destinadas a outras análises bioquímicas e sorológicas devem ser congeladas. O líquor da seção de hematologia deverá ser refrigerado se não for possível fazer contagem celular do mesmo em uma hora; o da microbiologia mantido à temperatura ambiente e analisado o mais depressa possível. •

URINA TIPO I (STRASINGER, 1998) TÉCNICA - Num tubo uroanálise, colocar 10 mL de urina. - ar a fita reativa e anotar os resultados. Onde for positivo, colocar a

alteração. - Calibrar o tubo e centrifugar a 2500 RPM por 5 minutos. - Inverter o tubo no container até que reste 1 ml. - Contar na câmara de Neubauer. EXAME FÍSICO E FITA REATIVA Analisa-se macroscopicamente alguns aspectos da urina. Mergulha-se a fita na urina e através de uma reação de cor analisada-se os seguintes itens: - Cor: Varia de amarelo claro a âmbar. - Aspecto: Varia de levemente turvo a fortemente turvo.

- pH: Embora

um indivíduo sadio geralmente produza a primeira urina da

manhã com pH ligeiramente ácido, entre 5.0 e 6.0, o pH normal das outras amostras do dia podem varias de 4.5 a 8.0. - Densidade: É uma medida da densidade das substâncias químicas dissolvidas na amostra. Geralmente é medida na fita reativa ou pelo refratômetro. A densidade normal da urina varia de 1.010 a 1.030. - Proteínas: A constatação de proteínas nem sempre significa doença renal, mas sua presença realmente exige a realização de outras análises para verificar a normalidade ou anormalidade do quadro. - Glicose: devido à sua utilidade na detecção e no controle do Diabetes melito, o teste de glicosúria é a análise bioquímica realizada com maior freqüência na urina. - Corpos cetônicos: Normalmente não aparecem em quantidades mensuráveis na urina, pois toda gordura metabolizada é completamente degradada e convertida em dióxido de carbono e água. - Sangue: Pode estar presente na forma de hemácias íntegras ou de hemoglobina. Se encontrar Hemoglobina e mioglobina na câmara, terá que aparecer na fita. Daí pesquisa-se sangue oculto. - Bilirrubina: Sua presença pode ser a primeira indicação de hepatopatia, e muitas vezes é detectada bem antes do desenvolvimento de icterícia. - Urobilinogênio: É um pigmento biliar resultante da degradação da hemoglobina. Aparece na urina porque, ao circular no sangue a caminho do fígado, pode ar pelos rins e ser filtrado pêlos glomérulos. - Nitrito: É um método rápido de detectar infecções do trato urinário. EXAME QUÍMICO E SEDIMENTOSCOPIA Na câmara de Neubauer, conta-se os 4 quadrantes laterais (eritrócitos) e multiplica por 250 ou conta 1 quadrante e multiplica por 1000. Este último é mais utilizado. Faz-se isso para contagem de hemácias e leucócitos. Procura-se por: - Hemácias - Leucócitos - Células

- Cilindros: Pode ocorrer em exercícios físicos intensos. Conta-se os 4 quadrantes e multiplica por 110. Os mais encontrados são os epiteliais e os hialinos. Se tem cilindros, tem proteínas. - Bactérias: Podem apresentar bactérias nitrificantes e não nitrificantes. Se tem bactérias, tem leucócitos. - Leveduras: Ocorre quase sempre em glicosúria e conta-se em cruzes de 1a 4. - Muco - Cristais: Caso encontrados, soltar resultados em cruzes de 1 a 4. Em RN é comum encontrar cristais de urato. - Outros - Parasitas, espermatozóides, cálculos, artefatos, etc. TESTES BIOQUÍMICOS - Proteinuria 2 mL de Ac. Sulfossalicílico a 3% 0,5 mL de urina Homogeneizar. 

Resultado: +

Formação de turvação - Proteína de 24 hs (Quantitativo) Homogeneizar a amostra e medir o volume com precisão. Ácido Sulfossalicílico Água destiliada Amostra

Branco 2.0 mL 0.5 mL

Amostra 2.0 mL 0.5 mL

Homogeneizar, aguardar 10 minutos em TA e verificar a Abs. em 560 nm. 

Resultado: Ptn 24 hs: volume 24 hs x Fator (1.74) x Abs. A V.R.: até 150 mg/dL - Proteína Ortostática ou Postural

Ocorre em paciente que permanece, longos períodos sentados ou em pé, onde os rins são comprimidos pelos órgãos superiores - diminuição da reabsorção de proteína - proteinuria. Coleta-se um amostra após o paciente ter permanecido um período sentado (2 hs) - RESULTADO POSITIVO. Para confirmação, coleta-se uma

outra amostra, a primeira da manhã -

RESULTADO NEGATIVO - Ptn Ortostática ou Postural. - Proteína de Bence Jones Mieloma múltiplo - Proliferação dos plasmócitos - Liberação de microglobulinas (Bence Jones) - Baixo peso molecular - Proteinuria. Levar cerca de 5 mL de urina ao BM 50 - 60ºC e levar ao BM 100º por 5 minutos. Se ficar límpida, confirma-se Proteínas de Bence Jones. Se continuar turvo, pode ser qualquer outro tipo de proteína. Característica: Desnatura aos 50-60º C e torna-se límpida aos 100º C. Se der positivo, confirmar com eletroforese ou contraimunoeletroforese. - Glicosúria 2 mL de Reativo de Benedict 4 gotas de urina Homogeneíza. Coloca em banho fervente por 5 minutos. + Resultado: Marron Tijolo: ++++ Verde com sedimento amarelo: +++ Verde sem sedimento amarelo: ++ Verde claro: + Azul: Negativo - Corpo Cetônicos 1 mL de urina 6 gotas de Reativo de Imbert

Homogeneizar Acrescentar 1 mL de hidróxido de Amônia vagarosamente pelas bordas do tubo.  Resultado Formação de halo roxo entre duas fases. •

URINA TIPO II (STRASINGER, 1998)

Faz-se a análise tipo II geralmente em casos de cirrose, hepatopatias, anemia hemolítica. Pesquisa-se: •

PESQUISA DE HCG (STRASINGER, 1998) - Gravidez com resultado negativo Estágio inicial Gravidez ectópica Trimestre final da gravidez - Ausência de gravidez com resultado positivo (raro) Menopausa - gonadotrofina hipofisária Endocrinopatias -

LH

-Resultado positivo com taxa elevada de HCH •

Doenças trofoblásticas:

Mola hidatiforme Coriocarcinoma •

Reação de aglutinação em látex

•

Imunocromatocráfico (Ac monoclonal)

Observações: - Esse hormônio aparece primeiramente no soro e, depois da sobrecarga sanguínea, é excretado na urina.

- No trimestre final pode ocorrer HCG negativo em caso de aborto, com a placenta inativa. - Doenças trofoblásticas liberam grande concentração de HCG. - Pesquisa de HCG em homens: suspeita de CA de testículo.

- Urobilinogênio 2,5 mL de urina 0,5 mL reativo de Erlich Positivo se forma coloração vermelha. Caso de positivo, realizar diluição sucessivas, começando com 1,0 mL de urina + 9,0 mL de água destilada. Diluição de 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160. Adiciona 1,0 mL de reativo de Erlich.  Resultado: Urobilinogênio: 1/? EU (Unidade Erlich) - Pigmentos Biliares 1,0 mL ácido nítrico 1,0 mL de urina, pelas bordas do tubo, vagarosamente. Positivo se formar um halo verde. - Pesquisa de Sangue Oculto Centrifugar 10 mL de urina a 2000 RPM pôr 5 minutos. Desprezar todo o sobrenadante Acrescentar 6 gotas do Reativo de Benzidina Positivo se formar um coloração de azul a verde. Reativo de Benzidina: Uma porçãode Benzina 1,0 mL H2O2

1,0 mL de ácida acético 50% Homogeneizar  Preparar o reativo somente na hora do uso. •

HCG de 24 horas

Sucessivas diluição a começar de 1 / 2.  Resultado: Volume de 24 hs x ultima diluição positiva x 2,5 = ? UI/24 horas •

LÍQUIDO CORPORAIS (STRASINGER, 1998)

- ANÁLISES DO LCR A) Exame físico Aspecto: Antes de centrifugar: vermelho / turvo Depois de centrifugar: deve diferenciar o LCR  Para diferenciar Punção Traumática de hemorragia Intracraniana. 1) Após centrifugação PT: forma sedimento (botão de hemácias e sobrenadante límpido) HI: não forma sedimento. 2) Distribuição desigual de sangue nos tubos PT: a quantidade de sangue vai diminuindo nos tubos. HI: Os três tubos permanecem vermelho por igual. 3) Formação de coágulo PT: não forma coágulo HI: forma coágulo B) Exames microscópico a) Contagem Global - Leucócitos:--- mm³ - Hemácias: 0-5 / mm³; RN.: até 100/mm³

Homogeneizar o material e preencher a câmara de Fuchs Rosenthal. Contar todos os quadrantes e dividir o número de células contadas por 3. b) Contagem Diferencial Concentrar o material e fazer esfregaço com a câmara de Suta. Corar com Leishman, Wright ou Giemsa. Contar 100 Células: - neutrófilos (Meningite bacteriana) - linfócitos (Menegite viral) - eosinofilos (Neurocisticercose) - monócitos (Meningite turbelosa e fúngida) C) Exame químico Glicose (60% glicose plasmática) Proteína: 15 - 40 mg/dL - ESPERMOGRAMA A) Fases 1ª fase: Liquefação primária ou virtual 2ª fase: Coagulação (duração até 30 minutos) 3ª fase: Liquefação secundaria. Ausência dessa fase → INFERTILIDADE B) Contagem Global Homogeneizar a amostra e diluir em 1/40 (3.9 mL solvente fisiológico + 100uL de esperma). Preencher a câmara de Neubauer. Contar SPTZ em objetiva de 40 X nos quadrantes laterais e central, multiplicar o número o contado por 80.000. Se a quantidade de SPTZ for muito elevado, contar apenas o quadrante central e multiplicar por 400.000. Resultados expressos em mL. V.R.:

60 milhões/mL

C) Viabilidade Em um tubo, colocar uma gota de esperma e acrescentar 2 gotas de eosina + 2gotas de nigrosina. Confeccionar esfregaço e secar rapidamente. Verificar a quantidade de SPTZ vivos (brancos) e mortos (vermelhos) - Objetiva de imersão. Vivos: mais do que 70% Mortos: menos do que 30%

PROCEDIMENTO DE ROTINA PARASITOLOGIA

EXAME PARASITOLOGIA DE FEZES O exame é utilizado no diagnóstico das parasitoses intestinais e tem como objetivo o encontro de trofozoítas e cistos de protozoários e ovos ou larvas de helmintos. Um resultado parasitológico negativo não exclui a possibilidade de infecção por parasitas, levando em consideração a idade da infecção e as "fases negativas" de determinados parasitas, como a Giárdia lamblia, por exemplo. Os ovos de Taenia sp. (solitária) e Enterobius vermicularis (oxiúrus) raramente são encontrados nas fezes, sendo mais comumente encontrados na região perianal. Os seguintes parasitas intestinais são patogênicos e devem ser erradicados: - Ascaris lumbricoides - Capillaria hepática - Clonorchis sinensis - Blastocystis hominis - Cyclospora - Cryptosporidium (quando em imunodeprimidos) - Dientamoeba fragilis - Dipylidium caninum - Diphyllobotrium latum - Entamoeba hispolytica - Enterobius vermiculares - Giárdia lamblia - Hymenolepis diminuta

- Hymenolepis nana - Isospora belli - Isospora spp. - Microsporídia - Progonimus westermani - Strongyloides stercoralis - Trichuris trihiura - Schistosoma mansoni - Ancilostomideos Não é necessária medição quando são encontrados os seguintes parasitas não patogênicos: - Chilomastix mesnili - Cryptosporidium (quando em imunocompetendes) - Endolinax nana - Entamoeba coli - Entamoeba hartmani - Iodanoeba bütschlii MATERIAL / AMOSTRA A amostra fecal deve ser colhida diretamente no frasco ou em um urinol, ou ainda em jornal ou papel limpo, e transferidas diretamente para o frasco coletor. O frasco coletor deve estar livre de anti-sépticos, agentes germicidas, de gotas de óleo e de urina, para evitar a destruição de formas vegetativas dos parasitas. Fezes obtidas de vasos sanitários não podem ser utilizadas. Cada amostra deverá apresentar no mínimo, as seguintes informações: nome do paciente, número de identificação, nome do médico, data e horário da colheita, e deverá vir acompanhada do pedido médico indicando qual o procedimento laboratorial a ser seguido.

Os recipientes com amostras fecais recebidos de pacientes com AIDS deverão ser protegidos por um invólucro de plástico e identificados com etiquetas vermelha ou HIV positivo. O ideal para a certeza diagnóstica é a realização de exames em três amostras obtidas em dias alternados. O uso de laxantes só é indicado caso haja uma série de exames negativos em pacientes com suspeita clínica. Nestes casos istrar laxantes salinos. Óleos minerais (nujol etc.) e compostos de bismuto e magnésio não devem ser empregados por interferirem no resultado dos exames. As fezes obtidas por uso de laxantes devem ser levadas imediatamente ao laboratório. O tempo de colheita da amostra fecal influência diretamente na identificação dos parasitas. Por essa razão amostra fecais diarréicas e pastosas devem ser levadas ao laboratório após no máximo, 30 minutos após a evacuação. As amostras fecais sólidas devem ser entregues no laboratório até 2 horas sem refrigerar e no máximo até 14 horas se mantidas sob refrigeração (não congelar!). Quanto ao uso de medicamentos, o ideal é não ter usado anti-parasitários e antibióticos nas últimas 3 semanas e antidiarréicos e antiinflamatórios nas 72 horas que antecedem a coleta. METODOS - Técnicas de concentração: métodos de Faust (centrifugação-flutuação em solução saturada de sulfato de zinco) e método de Lutz

ou Hoffman, Pons Er Janes)

sedimentação espontânea em água) - Exame direto à fresco: realizado se a amostra for diarréica ou se apresentar muco, pus ou sangue. - Exame quantitativo para contagem de ovos de helmintos nas fezes: métodos de KatoKatz. - Técnica de isolamento de larvas de nematódeos: métodos de Rgai. PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES

O teste é realizado no auxilio ao diagnóstico de lesões sangrantes da mucosa de porções baixas do trato digestório (especialmente lesões dos cólons) e como métodos de triagem no diagnostico precoce do câncer dos cólons em indivíduos acima dos 40 anos. A pesquisa de sangue oculto nas fezes deve ser precedida de dieta rigorosa por quatro dias, da qual se excluem as carnes, os vegetais verdes (clorofila) e os medicamentos à base de ferro; e deve ser feita em amostra fecal recentemente emitida. MÉTODO DE EXAME DIRETO À FRESCO Um procedimento simples e eficiente para o estudo das fezes, permitindo observar as formas trofozoítas vivas dos protozoários. Os esfregaços com fezes frescas e não fixadas são preparados com soluções salina fisiológica a 0,85% e de Iodo de Lugol, separadamente. Os esfregaço deverão ser sistemáticos e completamente examinados através de objetiva de microccópio de pequeno aumento (10x) e com pequena intensidade de luz. A confirmação dos parasitas deve ser realizada com objetiva de grande aumento (40 x). SOLUÇÃO SALINA FISIOLÓGICA A 0,85% Cloreto de sódio (NaCI) ---------------------------------------------------------------------------- 8,5 g Água destilada-deionizada ----------------------------------------------------------------------1000 ml MÉTODO DE CENTRÍFUGO-FLUTUAÇÃO EM SOLUÇÃO DE SULFATO DE ZINCO (MÉTODO DE FAUST et al., 1938) Procedimento utilizado para diagnostico de cistos de protozoários e ovos de larvas de helmintos, ovos grandes de trematódeos, de cestódeos e inférteis de Ascaris lumbricoides não são concentrados por este método, devido à sua densidade ser maior do que a da solução ser sulfato de zinco utilizada, não permitindo sua flutuação. É um método impróprio para fazer contendo grande quantidade de gordura. 

Colocar 1 ou 2 g de fezes coletadas de várias partes do boldo fecal em frasco contendo 10 mL de água corrente.



Homogeneizar e filtrar a suspensão através de gaze dobrada quatro vezes, e receber o filtrado em um tubo cônico de centrífuga de 15 mL.



Adicionar água corrente até completar 2/3 da capacidade do tubo. Centrifugar a 2.500 r.p.m por 60'.



Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 mL de água corrente ao sedimento, antes de ressuspendê-lo. Completar com água corrente 2/3 do volume do tubo, agitar e centrifugar.



Repetir a etapa anterior até que o sobrenadante apresente-se relativamente claro.



Depois que o último sobrenadante é descartado, adicionar a 1 a 2 mL de solução de sulfato de zinco (d= 1,18 g/mL) e ressuspender o sedimento. Completar com o mesmo reagente até 0,5 cm da borda do tubo e centrifugar.



Cuidadosamente, remover o tubo da centrifuga e, sem agitação, colocá-lo em uma estante em posição vertical.



Com uma alça de arame (diâmetro de 5 e 7 mm) tocar o centro da membrana formada na superfície, transferindo varias alçadas para uma lâmina de microscópica.



Colocar 1 gota de Lugol e lamínula. Examinar no microscópio óptico em aumento de 100x.

SOLUÇÃO DE SULFATO DE ZINCO (d= 1,18 g/mL) - sulfato de zinco (ZnSo4) ------------------------------------------------------------------------- 330 g - água destilada-deionizada --------------------------------------------------------------------- 670 mL Ajustar a densidade da solução com densitômetro pela adição de sal ou água e filtrar em papel-filtro. MÉTODO DE SEDIMENTAÇÃO ESPONTÂNEA EM AGUA (MÉTODO DE LUZTZ, 1919; HOFFMAN, PONS E JANER, 1934) Método é indicado para pesquisa de ovos e larvas de helmintos e cistos de protozoários. Fundamenta-se na sedimentação espontânea em água, havendo uma

necessidade mínima de vidrarias e sendo dispensável o uso de reagentes e centrifugação. - Colocar cerca de 5g de fezes, coletados de várias partes do bolo fecal, em um corpo graduado ou em bequer de 250 mL. Completar o volume de 50 a 60 mL com água corrente e homogeneizar. - Preparar a suspensão adicionando 100 mL de água corrente. - Filtrar essa suspensão de gaze dobrada quatro vezes, recolhendo-se em cálices de sedimentação com capacidade de 125 mL. - Se necessária adicionar água corrente até completar aproximadamente 3/4 do volume do cálice cônico. Deixar a suspensão em repouso durante 1 a 2 horas. - Com uma longa pipeta capilar ou em canudo plástico, colher uma pequena porção do sedimento e depositar sobre uma lâmina de microscópica. Se o sedimento estiver muito espesso, diluir com uma gota de solução salina a 0,85% ou água corrente. - Colocar 1 gota de Lugol e cobrir com lamínula. Examinar no microscópio óptico em aumento de 100 x. OBS: A amostra pode ser sedimentada por um tempo maior, a fim de aumentar a concentração de cistos de protozoários e ovos leves de helmintos no sedimento. MÉTODO MODIFICADO DE KATO-KATZ (KATO, 1960; KATZ, CHAVES & PELLEGRINO, 1972) É um método de esfregaço espesso em celofane, amplamente utilizado na rotina para determinar quantitativamente o número de ovos por grama de fezes (OPG). - Colocar a amostra fecal sobre papel absorvente. - Comprimir a tela metálica (60 ou 80 malhas) ou de náilon (105 malhas) sobre as fezes, fazendo com que parte e através das malhas. - Remover as fezes que am através das malhas e transferi-las para o orifício de um cartão retangular (3 cm x 4 cm x 1,37 mm, com orifício central de 6 mm de diâmetro), colocado sobre uma lâmina de microscópica.

- Depois de preencher o orifício do cartão com a amostra, removê-lo com cuidado, deixando as fezes na lâmina. - Cobrir as fezes com uma lamínula de celofane, invertendo e pressionando a lâmina sobre o papel absorvente. - Deixar a preparação em repouso para clarificação da amostra durante 30 minutos a 34 - 40ºC ou à temperatura ambiente por 1 a 2 horas. - Examinar a preparação no microscópio óptico em aumento de 100 x. - Contar o número de ovos. - O número de ovos presentes na preparação multiplicado pelo fator 23 dará o número de ovos por grama (OPG) de fezes.

SOLUÇÃO AQUOSA GLICERINADA DE VERDE MALAQUITA - solução aquosa de verde malaquita a 3% (m/v) ------------------------------------------- 1 mL - solução aquosa de fenol a 6% (m/v) -------------------------------------------------------- 100 mL - glicerina -------------------------------------------------------------------------------------------- 100 mL

MÉTODO PARA ISOLAMENTO DE LARVAS DE NEMATÓIDEOS (MÉTODO DE RUGAI, MATTOS & BRISOLA, 1954) Este método fundamenta-se

no termo e hidrotropismo positivo das larvas de

nematódeos, indicado para pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis. - Estender, sobre a abertura de um recipiente contendo fezes, gaze dobrada quatro vezes, e repuxar as extremidades para trás. - Encher, com aproximadamente 70 a 100 mL de água corrente aquecida a 40 - 50 ºC, um cálice cônico de sedimentação (capacidade 125 mL). - Transferir o recipiente com as fezes para o interior do cálice de sedimentação, de modo que o líquido alcance toda a extensão da abertura do recipiente, cuidando para não haver formação de bolhas de ar. - Deixar em repouso durante 60 minutos.

- Colher o sedimento entre lâmina e lamínula no menor aumento do microscópio óptico, ou em um vidro de relógio, com auxilio de uma lupa. COPROTEST - Princípio: Centrífugo-sedimentação. - Finalidade: Pesquisa de ovos, cistos e larvas. •

Abra o frasco cuidado cuidadosamente para não derramar o conteúdo;

•

Colher a amostra e colocar na cavidade do coletor;

•

Agite o frasco vigorosamente por mais ou menos 2 minutos;

•

Em um tubo graduado, colher 7 mL da amostra, acrescentando 1 gota de detergente e 3 ml de acetato de etila comercial;

•

Tampe o tubo, agite e centrifugue a 1.500 RPM/ 2 minutos;

•

Despreze o sobrenadante com cuidado;

•

Acrescente 1 gota de lugol e 1 gota de solução fisiológica ao sedimento;

•

Ressuspenda o sedimento, colha 1 gota na lâmina e cubra com lamínula;

•

Observar ao microscópio com aumentos de 10X e 40X.

PROCEDIMENTO DE ROTINA MICROBIOLOGICA

MICROBIOLOGIA Nos

últimos

30

anos,

a

Microbiologia

e

Imunologia

evoluíram

extraordinariamente como ciência multidisciplinares, em relação estreita com a Biologia Molecular. No campo da Microbiologia Geral, enormes progressos foram realizados com referência à anatomia química e morfológica da célula bacteriana, à biossíntese da macromolécula e à genética de m. o. Tudo isso contribui fundamentalmente à Genética Moderna. (BIER, 1990). OBJETIVOS O objetivo dos estudos no setor de Microbiologia é demonstrar aos alunos estagiários uma visão ampla das principais técnicas e métodos dentro de um laboratório, com fins diagnósticos. Observa-se também uma padronização e simplificação da metodologia utilizada na identificação desses microorganismos. MEIOS DE CULTURA

Para o cultivo de bactérias podem ser utilizados meios líquidos, sólidos ou semi-sólidos. Meios líquidos permitem o crescimento indiferenciado de todas as bactérias contidas na amostra promovendo turvação do meio. Meios sólidos possibilitam crescimento de amostras de bactérias puras. Sua consistência sólida é devido à adição de ágar e o simi-sólido contém menor quantidade ágar e é utilizado geralmente para verificar a motibilidade das bactérias. •

Meio sólido – 1.5% de agar

•

Meio semi-sólido – 0.4% de agar

Classificação - Meio Diferencial – Permitem a distinção entre 2 ou mais tipos de bactérias pela simples observação das características apresentadas pelas colônias que nele se desenvolvem. Ex: Ágar Sangue; Meio de MacConkey. - Meio Seletivo – Meios que contêm substancia capazes de inibir o crescimento de determinados grupos de bactérias sem restringir o crescimento de outras. Ex: Ágar Sangue; Meio de MacConkey. - Meio de Enriquecimento – Rico em nutrientes que proporcionam o aumento do número de bactérias. Preparo de Meios Forma preparados meios de cultura, para utilização durante o estagio, seguindo a formula indicada pelo fabricante de cada meio. Técnicas de Semeadura - Esgotamento – Consiste em espalhar o material biológico com auxilio da alça, fazendo estrias próximos até o esgotamento do material, para que haja um bom isolamento das bactérias. - Atapetamento – Geralmente utilizado para contagem de bactérias de amostra urinaria, onde utiliza-se a alça da Dirigalsky.

- Espalhamento – Utilizado para espalhar todo o material biológico por toda a placa, com auxílio da alça de platina em, pelo menos, 3 sentidos. - Semeadura em tubos – Podem apresentar-se em forma de ágar inclinado, líquidos ou semi-sólidos. Para a inoculação, usa-se a alça bacteriológica e na transferência de cultura pura e placas para tubos usa-se agulha bacteriológica. Coloração de GRAM A maioria das amostras colhidas, quando se suspeita de infecção bacteriana, deve se aplacada a lâminas de vidro, coradas pelo Gram e examinadas ao microscópio. - A lâmina é fixada e tratada com solução de cristal violeta 1 a 2 minutos; - Lavar com água e escorrer; - Descorar rapidamente pelo álcool a 95%; - Lavar com água e escorrer; - Cobrir com solução de fucsina, durante 30 segundos para contra – corar; - Lavar com água, secar com papel de filtro, observar na objetiva de imersão (100x).

Diferenciação de Bactérias Para bactérias Gram positivas faz-se a prova da catalase, onde reação positiva indentifica Staphylococcus e a reação negativa identifica Streptococcus. 1) Identificação de Bacterias - PROVA DA CATALASE –

Os staphylococcus produzem a enzima catalase

(peroxidase) que é capaz de decompor o peróxido de hidrogênio (H2O2) em O2O. Execução: preparar um suspensão do crescimento bacteriano em H 2O destilada na superfície da lâmina e adicionar 1 a 2 gotas de H2O2 a 3%. O aparecimento de bolhas indica reação positiva. O aparecimento de bolhas indica reação positiva. Para a diferenciação entre as espécies de Staphylococcus, é necessário proceder às provas bioquímicas, a partir de amostra isolada.

- PROCA DA COAGULASE – A coagulase ligada esta localizada na superfície da parede células e reage com caldeias α e β do fibrinogênio plasmático, provocando a formação de coágulo visível, resultando em uma reação positiva. Coagulase + - S. aureus Coagulase - - S. epidemeridis ou S. saprophyticus - PROVA DA DNASE – Determina a atividade da enzima desoxirribonuclease produzida por amostras de S. aureus. Execução: Semeadura da amostra em ágar DNAase. Incubar a placa a 35 – 37ºC / 18-24 hs. Cobrir a placa com solução de ácido clorídrico a 1N. Resultado positivo se dá pela formação de um halo ao redor da colônias e resultado negativo evidencia truvação uniforme em toda superfície do meio. - TESTE DE SENSIBILIDADE À NOVOBIOCINA – Diferencia os staphylococcus coagulase negativos de importância médica. Execução: Semeia-se o microorganismo em ágar sangue e aplica-se disco de Novobiocina. Incuubar a placa a 35 – 37º C / 18-24 hs. Formando-se um halo de sensibilidade caracteriza-se presença de S. epidermidis. ESQUEMA: Catalase + - Staphylococcus Catalase - - Staphylococcus

Coagulase DNAase Sensibilidade Novobiocina

S. aureus + + à Sensível

S. epidermidis Sensível

S. saprophyticus Resistente

2) Identificação de Streptococcus A designação mais utilizada tem por base os tipos de hemólise em placas de ágar sangue: - Hemólise total - β -hemolítico - Hemólise parcial – α –hemolítico - Ausência de hemólise – Y – hemolítico As colônias podem ser repicadas para caldo HBI por 6 a 8 horas ou retiradas do crescimento inicial em ágar sangue para realização das provas de identificação. - TESTE CAMP – Principio dado pela atividade hemolítica do staphylococcus produtor de beta lisina em eritrócito é fundamentada por um fator extracelular, de constituição protéica, produzida pelo estrephytococcus de grupo “B”, chamado fator CAMP. Uma reação beta-hemolítica é acentuada quando estes m.o. reagem sinergicamente, em placas de ágar sangue. Execução: Semeia-se uma estria de Staphylococcus aureus produtor de beta lisina no centro de uma placa de ágar sangue feita com sangue de carneiro. Estria, perpendicularmente, o strephytococcus a ser identificado, de modo que as estrias não se toquem. Incubar a placa a 37ºC/ 24hs. Um alargamento da zona do lise no ponto de interseção entre as duas estrias, que toma a forma de ponta de lança, evidencia-se prova positiva para S. agalactiae, strephytococcus β – Hemolítico do grupo “B”. - PROVA DA BILE ESCULINA – Os strephylococcus do grupo “D” em meio com bile na concentração de 4%, hidrolisam a esculina, originando a esculitina a qual reage com citrato férrico contido no meio, provocando o escurecimento do meio em torno das colônias. Execução: Semeia-se 2 a 3 colônias, da placa de ágar sangue, em tubo com ágar bile esculina esculinado. Incubar a placa a 37º C/24hs. O escurecimento em torno do crescimento evidencia-se prova positiva.

- PROVA DE TOLERÂNCIA A 6.5% DE NACL – Os strephytococcus do grupo “D” em meio contendo 6.5% de NaCl e modificam sua coloração são classificados como “enterococos” , os negativos são os “não enterococos”. Execução: Inocula-se 2 a 3 colonias suspeitas em caldo HBI contendo 6.5% de NaCl, 1% de glicose e um sistema indicador de pH. Incubar a placa a 37ºC/24hs. O crescimento com conseqüente mudança de coloração do meio indica se tratar de amostras E. faecalis. - TETE BA BACITRACINA – Em concentração de 0.04 mg, a bacitracina age seletivamente sobre os strephytococcus β – hemolítico do grupo “A” de Lacenfield inibindo a síntese do peptidoglicano e alterando a seletividade da membrana celular. Com isso, impedindo que as bactérias se desenvolvam na região do meio de cultivo onde houve a difusão do sal, acarretando a formação de um halo de inibição. Execução: Inocular na superfície de uma placa de ágar sangue colônias suspeitas, vindas do caldo HBI ou da placa incial. Após secagem, aplica-se o disco de bacitracina no centro da área semeada, pressionando levemente para conferiir aderência. Incubar a placa a 37ºC/24hs. Resultado positivo para S. pyogens do grupo “A” é conferido com o aparecimento de um halo de inibição. - TESTE DA OPTOQUINA – A optoquina (cloridrato de estilhidrocupreína) altera seletivamente

a

membrana

celular

do

S.

pneuminiae,

servindo

como

os

estrephytococcus ao grupo “viridans”. Execução: Semear de 2 a 3 colonias da bactérias suspeita em plac de ágar sangue. Após secagem, aplica-se o disco de optoquina, na concentração de mg no centro da área semeada, pressionando levemente para conferir aderência. Incubar a placa a 37º C/24Hs, em jarra com vela. Crescimento de halo de inibição de 14 a 18 mm indica sensibildade caracterisitca de S. pneumoniae. Em caso de resitencia à optoquina com bile sculina negativa, trata-se de S. viridans. Enterobacteias (bastonetes Gram negativos)

Os bastonetes Gram negativos encontrados em laboratórios são classificados em 2 grupos: - Produção de ácidos a partir da oxidação da glicose. Principais gêneros: Pseudomonas, Alcaligenes e Acinetobacter. - Produção de ácidos a partir da fermentação da glicose. Principais genereos: família enterobacteriaceae (oxidase negativos) e os não pertencentes a essa família (oxidase positivos). PROVAS BIOQUÍMICAS - URÉIA Determina a capacidade de um m. o. em degradar enzimaticamente moléculas de uréia do meio, formando carbonato de amônia. A hidrólise é catalisada de forma especifica pela uréase produzindo 2 moléculas de amônia. O vermelho de fenol que funciona como indicador, torna o meio rosa-avermelhado quando a reação for positiva. - MILI a) LISINA – Baseia-se na produção de lisina descarboxilase e liberação de gás sulfídrico. A reação positiva é favorecida com o aparecimento de cor púrpura, que coincide com a cor inicial do meio. Reação negativa é caracterizada por uma coloração amarelada. A produção de H2S é evidenciada pelo aparecimento de um precipitado negro. b) MOTILIDADE – Caracterizada pelo aparecimento de turvação uniforme em toda extensão do meio. Bactérias imóveis crescem apenas no local da inoculação. c) INDOL – É evidenciado após degradação do aminoácido triptofano pelas triptofanases. A positividade é conferida pela adição do Reativo de Kovacs, onde se forma um anel vermelho na camada superficial do meio. - CITRATO Baseia-se na utilização do citrato como única fonte de carbono. Utiliza-se o bromotimol como indicador de pH, que oferece coloração amarela em meio ácido e azul em meio alcalino.

- TSI Determina a habilidade de um m. o. em utilizar carboidratos específicos existentes no meio básico com ou sem produção de gás ou H2S. a) FERMENTAÇÃO DA GLICOSE – Observa-se no fundo do tubo a degradação protéica que é insuficiente para reverter o pH ácido estabelecido, mantendo o meio amarelo. b) FERMENTAÇÃO DA LACTOSE E SACAROSE – o tubo permanece amarelo no ápice do meio devido a alta concentração de ácidos produzidos. c) PRODUÇÃO DE GÁS – Evidencia-se o aparecimento de bolhas ou rachaduras no meio. d) PRODUÇÃO DE H2S- Reação com sulfato ferroso contido no meio, resultando em um precipitado negro. - FENILALANINA Para se fazer a leitura, deve-se adicionar 4 gotas de cloreto férrico que reage com o ácido fenilpirúvico. Se positivo, promove coloração verde. Se negativo, promove coloração amarela. - VM Para se fazer a leitura, acrescenta-se 5 gotas de vermelho de metila, eu por ser um indicador ácido, indica o grau de acidez por modificação de cor. Reação positiva dada por cor vermelha (pH = 4.5) e negativa com cor amarela (pH= 6.0). - VP Evidencia a capacidade da bactéria em produzir compostos neutros, a partir da fermentação da glicose. UROCULTURA - Coleta – Faz-se assepsia no local antes da coleta. Coleta-se o segundo jato usando frasco estéril.

- Conservação – Manter o material na geladeira pra inibir o crescimento bacteriano. • Meios de Cultura a) CLED – Meio não seletivo, diferencial para fermentação da lactose, formando colônias azuis quando lactose negativa. Utiliza-se como técnica de semeadura o método da alça calibrada de 0.01uL ou 0.001 uL, para que se possa fazer a contagem das colonias e posteriormente diagnosticar se há infecção ou não. - abaixo de 10.000 ufc/mL – contaminação - entre 10.000 e 100.000 ufc/mL – suspeita - acima 100.000 ufc/mL – infecção TESTE DE SENSIBILIDADE À ANTIMICROBIANOS I – Preparo do Inoculo Com o auxilio da alça, toca-se em uma colônia tranferindo-as pra um tubo de solução salina ou em caldo BHI para novo crescimento e depois em solução salina. Posteriormente compara essa turvação com a escala 0.5 de Mac Farland. II – Semeadura Umedecer o “swab” estéril no inoculo aferido e aplicá-loo em varias direções na placa com meio Mueller – Hinton, obtendo cresciemnto uniforme. III – Técnica Colocar os discos, com o auxilio de uma pinça, pressioná-los levemente contra a superfície do meio, mantendo uma distancia de 20 mm da boda e de 30 mm entre eles. Incubar a placa em posição invertida a 37ºC/ 18hs. A leitura deve ser feita com halômetro ou régua através do fundo da placa.

CULTURA DE SECREÇÃO VAGINAL E URETRAL A coleta da secreção vaginal e da uretral é feita no laboratório, se utilizado de cureta (para a vaginal) ou alça de platina (para a uretral). Uma parte do material é colocado em 1 mL de solução salina estéril, e outra parte é olocada na forma de esfregaço na região central de uma lamina para microscópio. Este material, em lâmina, é observado em microscópio óptico ao aumento de 1000 vezes com óleo de imersão e descrito: •

bactéria (morfologia e Gram);

•

leveduras;

•

parasitas;

•

muco;

•

células epiteliais;

•

flora aplobionte. Para essa observação utiliza-se a Coloração de Gram, que é realizada nesse

esfregaço após o mesmo ter sido fixado ando-se lâmina 3 vezes por sobre a chama do bico de busen. Feito isso, em um e próprio, cobre-se a lâmina com uma camada de corante cristal violeta por aproximadamente 1 minuto; após, recobre-se a lâmina com uma nova camada de lugol a 5% por mais 1 minuto. Em seguida despreza-se o material que esta sobre a lâmina e recobre-se a lâmina com álcool acetona, formando uma camada por sobre a lâmina, por 1 minuto. Após, enxaguar em água corrente. Em seguida, recobre-se, novamente, a lâmina com fucsina para a

Coloração de Gram por mais 1 minuto. A seguir, lavar em água corrente, colocar em e próprio para escorrer e secar. Após feita a observação e determinados os parâmetros, seguir o esquema descrito abaixo:

ESTREPTOCOCOS – NÃO BETAHEMOLITICO

Caldo glicosado

gram

Calatase

(-) estreptococo

(+) estafilococo

Verificar registro de hemólise no ág arsangue primario

Alfa ou gama hemolitico

Verificar origem do material para originar provas

(R) à optoquina bile-esculina (-)

Streptococcus sp

(S) à optoquina bile – solúvel

Bile-escilina (+)

antibiograma

S. pneumoniase

grupo D (S. faecalis e outros)

(R) a 6,5% NaCI (S) a 6,5% NaCI CULTURA DE FEZES (COPROCULTURA) (R) à penicilia

(S) à penicilia

Para a realização desse exame, as fezes são recolhias em recipiente próprio e estéril e entregues ao laboratório num período Maximo de 2 horas após a coleta. No setor, com uma alça de platina, é coletado uma porção das fezes e colocada em caldo selenito, que vai à estufa a 37º C por um período de 24 horas. Após este período, com uma alça de platina, recolhe-se parte desse caldo e semeia-se em estufas a 37ºC por 24 horas. Havendo crescimento, faz-se o Gram e as provas bioquímicas pertinentes conforme o esquema abaixo:

FEZES

CALDO SELENITO

BEM

SS

GRAM

COCCOS

BACILOS

NEG

POS

NEG

POS

Tubo Rugai

Tubo Rugai

Calase

TSI

Sem importancia clínica, provavelmente

TSI

VM, VP

Mili

contaminação

Mili

Plasmaco Halo de hemólise

Citrto

Citrato

Indol

Indol

Nitrito TSI

•

Citrato + = meio torna-se azul

•

TSI – H2 S + = meio torna-se negro; - Gás ++ aparecimento de bolhas no meio; - Lactose += A/A ou A/K (+)= K/K

•

K= alcalina=vermelho A= ácido=amarelo

Mili – motilidade ++ observa-se o caminho da bactéria no local da picada; - lisina += o meio torna-se amarelo; - indol += o reativo de Kovacs torna-se vermelho

CULTURA DE ESCARRO Para a cultura do escarro, podemos encontrar apenas solicitações de bacterioscopia como, por exemplo, pesquisa de BK; mas quando a solicitação for de cultura de escarro, devemos proceder como na cultura de secreções (exceto a coleta); Nas pesquisa de BK fazemos um esfregaço, na região central de uma lâmina, de porção do escarro rica em material sanguinolento (hemoptíase). Após secar esse esfregaço com a lâmina por sobre o a chama do bico de bunsen por 3 vezes, realizamos a coloração de ziehl – Neelsen que se rezume em: cobrir o esfregaço com uma camada de corante fucsina de ziehl e aquecer 5 minutos esta lâmina em chama do bico de bunsen sem deixar ferver o corante )retirar frequentemente da chama. Após isso, cobre-se a lâmina com álcool ácido por aproximadamente 1 minuto; enxaguar em água corrente e, depois, cobrir a lâmina com azul de metileno por aproximadamente 1 minuto. Lavar, novamente, em água corrente. Observar em microscópio óptico em aumento de 1000 vezes, utilizando óleo de imersão. PESQUISA DE FUNGOS Após coletar parte do material através de descamação com o bisturi ou coletar através de biópsia parte do material obtido, colocar em uma lâmina, cobrir KOH a 10% e sobre-por uma lamínula . Deixar por 10 minutos e observar ao microscópio óptico no aumento de 100 a 400 vezes: •

Hifas;

•

Micélio reprodutor;

•

Micélio vegetativo.

Em seguida, semia-se em ágar sabouraud por 48 a72 horas e, após o crescimentom observam-se morfologia, textura da colônia e fungos. Após isso, para a identificação, realização, realiza-se o auxograma e o zimograma conforme o esquema abaixo: OUTROS

MATERIAIS:

SECREÇÃO

DE

LESÕES,

LÍQUIDOS

SINOVIAIS

E

PLEURAIS Para estes casos a coleta é feita pelo médico que encainha os materiais sólidos em saliva e os líquidos em recipiente estéril. Com a chegada da matéria, faz-se uma lâmina para Gram e segue-se o esquema para secreções vaginal e uretral. Em todos os exames acima descritos (exceto as pesquisas de fungos e as bacteroscopias), devemos realizar o antibiograma feito em uma placa grande ágar Nueller Hinton com 11 discos de antimicrobianos, padronizados a critério do diretor clínico do hospital. Estes discos devem estar dispostos na placa de forma a apresentarem uma distância maior que 2 cm entre os seus centros e distarem 1 cm da borda de vidro da placa de petri. Efetuar a leitura dos balos de inibição de crescimento utilizando um halômetro e tabela própria do fabricante dos discos, observando as faixas de I (intermediária), S (sensível) e R (resistente). PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS LAVADAS (5%) 1. Coloque em um tubo de ensaio (12 x 75) previamente identificado 0,5 mL de sangue total 2. Encha o tubo com solução salina (0,9%) até 1 cm da borda do tubo. 3. Centrifugue durante 30 seg/3400 RPM. 4. Esvazie o tubo por inversão, homogenize o sedimento de hemácias, e repita conforme os itens 2 e 3 por mais duas vezes 5. Após a terceira lavagem, retire completamente o sobrenadante 6. Em outro tubo de ensaio coloque 3 ml de solução salina (0,9%) e adicione 0,15 ml do concentrado de hemácias lavadas.

CLASSIFICAÇÃO DO GRUPO SANGUINEO ABO A tipagem ABO dever ser realizado obrigatoriamente através de dois testes: classificação direta e classificação reversa. 1. Classificação direta (TUBO): Identificação de aglutinógeos presentes na membrana das hemácias, através de soros contendo anticorpos específicos: Anti-A, ANTI-B e ANTI-AB; TECNICA: 1.1 Prepare um suspensão de hemacias lavadas (5%) do sangue a ser classificado. 1.2 Identifique 3 tubos de ensaio: A, B e AB. 1.3 Coloque nos tubos, 1 gota dos soros reagentes: Anti-A, Anti_B e Anti-AB, respectivamente; 1.4 Adicione a cada tubo, 1 gota da suspensão de hemácias lavadas (5%) a classificar; 1.5 Homogenize e centrifugue 15 seg/3400 RPM 1.6 Proceda a leitura ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente, sobre um fundo iluminado (aglutinoscopio); 2. Classificação reversa (tubo): identificação de anticorpos presentes na amostra de soro a ser testado, através da utilização de duas suspensões de hemácias conhecidas: hemácias A1 e Hemácias B; TECNICA: 2.1 Identifique 2 tubos de ensaio: HÁ e HB; 2.2 Coloque em cada tubo 2 gotas do soro a testar;

2.3 Adicione ao tubo HÁ, 1 gota de hemácias A1 e ao tubo HB, 1 gota de hemácias B; 2.4 Homogenize e centrifugue 15 seg./3400 RPM; 2.5 Proceda leitura ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente; INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS DA CLASSIFICAÇÃO ABO DIRETA ANTI A 0 +4 0 +4

REVERSA ANTI-B 0 0 +4 +4

ANTI-AB 0 +4 +4 +4

ANTI-A1 0 + 0 +

H A1 +4 0 +4 0

HB +4 +4 0 0

HO 0 0 0 0

GRUPO O A1 B AB

DISCREPÂNCIA DIRETA ANTI A +4 +4 +4 +4

ANTI-B 0 0 +4 +4

REVERSA ANTI-AB +4 +4 +4 +4

ANTI-A1 0 + 0 +

H A1 0\+ + 0\+ +

HB +4 +4 0 +

HO 0 + 0 +

GRUPO A* A** AB** AB**

A*\AB** PROVAVEL SUBGRUPO DE A A**\AB** PROVAVEL ANTI-CORPO FRIO NOTAS: 1. Nas determinações ABO de recém nascido não se realiza prova reversa; 2. Podem ocorrer discrepâncias entre as provas e reversa, neste caso deve-se considerar a ocorrência de anticorpos frios, subgrupos ou erro técnico;

DETERMINAÇÃO DO FATOR Rh (D) Na determinação Rh são utilizados os reagentes: soro reagente Anti-D e controle e de Rh; 1. Prepare uma suspensão de hemácias lavadas (5%), do sangue a ser classificado; 2. Identifique 2 tubos de ensaio: D e CTL; 3. Coloque em cada um dos tubos 2 gotas dos soros: Anti_D e controle de Rh; 4. Adicione a cada tubo, 1 gota de suspensão de hemácias lavadas (5%), a classificar; 5. Homogenize e centrifugues 15 seg. 3400 RPM; 6. Proceda a leitura ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente, sobre um fundo iluminado (aglutinoscópio).

INTERPRETAÇÃO DO RESULTADO DA DETERMINAÇÃO Rh: ANTI A + 0 +

CONTROLE Rh 0 0 +

RESULTADO Rh POSITIVO Rh NEGATIVO ***

*** Não deve ser considerado Rh positivo, provável sensibilização das hemácias por auto-anticorpo. Realizar o teste com Anti-D Salino conforme recomendações técnica do fabricante. NOTAS: 1. Os resultados Rh negativos devem ser submetidos à pesquisa do antígeno “D” fraco. Deve-se pesquisar em paralelo a presença dos antígenos: E e C, utilizando-se o soro Anti- CDE.

PESQUISA DOS ANTIGENOS: “D” FRACO 1. Repita os procedimentos: 1.A 5. Da determinação do fator Rh. 2. Leve ao banho maria à 37º C\30 minutos; 3. Centrifugues durante 15 seg\3400 RPM; 4. Proceda leitura, ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente, sobre aglutinoscópio; 5. Encha o tubo de ensaio com solução salina (0,9%) ate 1 cm da borda do tubo; 6. Centrifugues durante 30 seg\3400 RPM; 7. Esvazie o tubo por inversão, e repita a operação conforme itens 5 e 6 por mais 2 vezes, escorrendo o sobrenadante em um pano; 8. Adicione a cada tubo, 2 gotas de soro reagente anti-globulina humana poliespecifica; 9. Centrifugue durante 15 seg\ 3400 RPM 10. Proceda leitura, ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente, sobre aglutinoscópio.

PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (P.A.I) (COOMBS INDIRETO) A pesquisa de anticorpos irregulares, demonstra anticorpos antieritrocitários irregulares, livres no soro ou plasma de doadores e pacientes, que possam provocar reações pós-transfusionais. Deve ser realizada também no soro de gestantes, como forma de prevenção da doença hemolítica do recém nascido. A pesquisa deve ser realizada com soro fresco (não inativo). São utilizadas suspensões de hemácias de triagem do grupo sanguíneo “O”, previamente fenotipadas e que apresentam a maioria dos antígenos de importância na clínica transfusional. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS DA P.A.I 1. A positividade em qualquer tubo, em qualquer fase do teste indica provável presença de anticorpo (s) irregulares (es); 2. Sempre que a pesquisa de anticorpos apresentar positividade, o (s) anticorpo )s) deve (m) ser identificados (s), atraves da utilização de um de hemácias fenotipadas.

TESTE DE COMPATIBILIDADE (Prova cruzada maior) A prova cruzada maior tem a finalidade de prevenir reações transfusionais e garantir o aproveitamento máximo das transfusões de concentrados de hemácias, por demonstrar a presença de anticorpos capazes de destruir as hemácias do doador proposto. O teste é realizado in vitro, colocando-se soro do receptor em contato com uma suspensão de hemácias do doador, proporcionando condições adequadas de reatividade para todos os anticorpos clinicamente significantes. Deve-se utilizar amostra de soro fresco (não inativo), tendo a amostra validade de 48 horas a contar do horário da coleta. Vencido o prazo de validade, esta amostra não deve ser mais utilizada nos testes de compatibilidade, porem armazena-se a amostra pelo prazo de sete dias.

TESTE DE COMPATIBILIDADE (PROVA CRUZADA MAIOR ) TECNICA: ALBUMINA BOVINA 22% 1ª FASE 1. Prepare suspensões de hemácias lavadas (5%): do concentrado de hemacais a ser transfundido e do paciente (recepto); 2. Identifique 2 tubos: Prova cruzada e AC (Auto controle); 3. Coloque em cada tubo 2 gotas do soro do paciente (receptor); 4. Adicione 1 gota da suspensão de hemácias do concentrado a ser transfundido ao tubo de prova cruzada e 1 gota da suspensão de hemácias do paciente ao tubo AC; 5. Homogenize e centrifugue durante 15 seg\3400 RPM; 6. Proceda a leitura, ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente sobre aglutinoscópio e anote os resultados. 2º FASE 1. Adicione a cada tubo 2 gotas de albumina bovina 22%; 2. Homogenize e centrifugue 15 seg\3400 RPM; 3. Proceda leitura e anote os resultados. 3º FASE 1. Incube os tubos: prova cruzada e AC, em banho maria 37ºC\30 min; 2. Após incubação, centrifugue os tubos 15 seg.\3400 RPM; 3. Proceda leitura e anote os resultados. 4º FASE 1. Encha os tubos com solução salina (0,9%) ate 1 cm da borda; 2. Centrifuge os tubos durante 30 seg\3400 RPM;

3. Esvazie os tubos por inversão e repita as operações dos itens da 4º fase (1 e 2) por mais 2 vezes, escorrendo o sobrenadante em um pano; 4. Adicione a cada tubo 2 gotas do soro reagente antiglobulina humana poliespecifica. 5. Homogenize e centrifugue 15 seg.\3400 RPM; 6. Proceda a leitura e anote os resultados; 7. Adicione 1 gota de suspensão de hemácias – controle de COOMBS, centrifugue e proceda leitura.

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS DO TESTE DE COMPATIBILIDADE

1. A positividade apenas no tubo de prova cruzada em qualquer fase do teste indica presença de anticorpos (s) irregular (es); 2. A positividade no tubo AC (Auto controle) indica provável presença de auto anticorpo. 3. Sempre que a prova cruzada apresentar incompatibilidade, ou seja, apresentar positividade, o (s) anticorpo (s) deve (m) ser identificado (s); 4. Suspensão de hemácias – controle de COOMBS deve apresentar aglutinação, caso contrario a prova de compatibilidade deve ser invalidada.

OBS: Não confundir a positividade do teste controle de COOMBS, com a última fase da prova de comaptibilidade.

TESTE DE COOMBS DIRETO O teste de COOMBS direto demonstra hemácias sensibilizadas por anticorpos ou complemento, é utilizado no estudo de: •

Anemia hemolítica auto-imune, doenças hemolítica do recém nascido e reação hemolítica transfusional.

Procedimento técnico: 1. Prepare uma suspensão de hemácias lavadas (5%), do sangue a ser testado; 2. identifique um tubo de hemólise CD; 3. Coloque no tubo 1 gota da suspensão de hemácias (5%); 4. Adicione a este tubo 2 gotas dos soro reagente anti-globulina humana poliespecifica; 5. Centrifugue o tubo durante 15 seg\3400 RPM; 6. Proceda leitura, ressuspendendo o botão de hemácias do fundo do tubo delicadamente, anote os resultados. INTERPRETAÇÃO A ocorrência de aglutinação, determina a positividade do teste.