Microorganismos Productores De Alcohol 31s3v

TECNICAS GENERALES EN MICROBIOLOGIA Microorganismos Productores de Alcohol

Jose María Xandri Tagueña

vinificatum.blogspot.com

MicroorganisDlos productores de alcohol

La fermentación alcohólica.- Microorganismos productores de alcohol etÍlico.- Desde tiempos más remotos y aún en estado muy primitivo de civilización, son conocidas las fermentaciones alcohólicas de los jugos de frutas y las de las mezclas derivadas de sacarificación de las sustancias amiláceas, fermentaciones expontáneas (al parecer) a veces y otras provocadas por siembras de materias de otra fermentación anterior... etc. Un sinnúmero de bebidas alcohólicas, el vino, la cerveza, las sidras y vinos de frutas, el' pombe africano, el sake japones... etc. derivan de éstos procesos que' desde hace siglos llamaron poderosamente la atención de los observadores, hasta-

el punto que la iniciación de la Microbiología hay que buscarla en los estudios de la fermentación alcohólica. La capacidad de formar alcohol y gas carbónico está muy difundida en las células de todas clases: los frutos maduros colocados en campanas de C02 o N, hojas, trozos de ramas y aún plantas verdes enteras colocadas en anaerobiosis, ciertos hongos en las mismas condiciones, dán alcohol, entre los microorganismos la facultad de producir alcohol y C02 a partir de hidratos de carbono, especialmente de los azúcares, está muy difundido, pero no llamaremos fermentos alcohólicos más que a aquellos que producen las mayores cantidades de alcohol y C02 con cantidades mÍnimas,relativamente, de otros productos (ácidos, alcoholes superiores, etc.) siendo por estas razones los agentes de las fermentaciones industriales. Así el Bacillus coli que produce alcohol de la dextrosa, los bacillus amylobacter que también producen alcohol de

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muchos hidratos de carbono, no son para nosotros fermentos alcohólicos y tampoco lo son otros esquizomicetos más activos en este sentido como un Bac ethacéticus (Franklanel) (20.110.100.94) de 1'5 - 5'1 x 0'8-1¡J que de la glucosa, sacarosa, lactosa, arabinosa, almidón, glicerina y manita produce alcohol etílico y ácidos acético y

fórmi-

co principalmente, ni el Bac. Manniticus de Gayón y Dubourg que produce a partir de la glucosa, alcohol etílico ( 22'7 % , ácido láctico, ácido acético y sucínico y gas carbónico). Los fermentos alcohólicos industriales son casi siempre Blastomicetos, de la familia de las Saccharomicetáceas (levaduras) interviniendo también algunas Mucedináceas del género Torulopxis de nuestra clasificación (pero que son universalmente de~ signadas con el nombre colectivo de Tórulas) y a veces algunos Eumicetos de los géneros Mucor, Rhizopus, Endomyces, Aspergillus... etc. que en condiciones de anaerobios producen fermentación alcohólica debil. Concretando más, las verdaderas levadurasalcohólicas son siempre de la familia de las Saccharomycetáceas. Estudio especial de los blastomicetos productores de alcohol (Ievaduras).En el estudio y diagnosis de las levaduras alcohólicas de caracteres más interesantes y mejor conocidos, por lo que sirven para la identificación de aquellas, son las siguientes: 1º.- Forma celular.- Haciendo observaciones en fresco bajo "cubre", o en cámara húmeda, de células de un depósito de cultivo líquido (por ejemplo de cultivo de mosto de cerveza, de 24 horas a 25 - 27 Q, medio adoptado por Hansen) se ve en los cultivos puros predominar una forma celular, aunque no todas las células sean exactamente iguales morfológicamente. Estas distintas formas celulares pueden agruparse, para el estudio, en los siguientes tipos: Tipo Cerevisiae de células redondeadas.- Tipo Elipsoideo de formas elipricas o de pera.- Tipo pasteuriano de células largas, en salchicha, o mazuelas.- Tipo Apinelado; con células provistas de mamelones polares, formas de limóll.- Tipo Sc hizosaccharomyces de células rectangulares o baciliformt:s, sin gemación, !l1ultipilicándose por esquizogenia.- Tipo Tórula, de células redondeadas, que presentan a la vez varias generaciones globosas.- Tipo Micoderma, de células cilíndricas, unidas en cadena, con gemación casi exclusivamente polar (Ver figuras ). Esras formas no son constantes para una misma especie y raza, más que en idénticas condiciones de medio; si ésre varía, varían tambien las formas según el súbnato nutritivo, temperatura, etc.. A veces en los cultivos sólidos y en los depósitos -

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de cultivos líquidos pero con mucha mayor frecuencia en los velos y membranas de la superficie de medios líquidos se observan formas alargadas, ramificadas que recuerdan en algo a los filamentos miceliares de los eumicetos.

En los cultivos envejecidos,

en las membranas y en los depósitos se observan alguna vez formas globosas con gruesa membrana y protoplasma muy granuloso ( glicógeno, grasas, etc. ) tales formas pueden considerarse como células durables ( *) que llevadas a un medio favorable reproducen por generación !as normales células vegetativas.

Los blastomicetos son todos -

inmóviles.

1.- Forma Cerevisiae. 2.- Idem Elipsoidea. 3.- Idem Pasteuriana. 4.- -

Idem Apiculada. 5.- Idem Schizoscharomyces. 6.- Idem Tórula.

7.--

Idem Micoderma. 8.- y 9.- Idem alargadas y filamentosas, micelares de levaduras en velos sobre medios líquidos. ( Según Verona ) 2º.- Agrupaciones celulares.- Al multiplicarse, por gemación, las levaduras pueden quedar aisladas o conservarse unidas generalmente en grupos poco numerosos: algunas veces, sin embargo, se producen reuniones de muchas células, formando agrupaciones ramificadas, en las que no se aislan por algún tiempo los individuos que la forman. ( *) De ninguna manera cabe confundir éstas células durables con las esporas propiamente dichas.

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Esta manera de agruparse es característica de algunas especies o variedades y y.. veremos que tienen alguna importancia para distinguir levaduras de fermentaciones alta y baja, si bien éstas distinciones no tienen nada en absoluto y varian con el medio.

Los velos o membranas y los anillos ( velos limitados a la parte del líquido -

nutritivo en o con las paredes) son agrupaciones características y ya veremos que son caracteres de gran interés para las levaduras las temperaturas máximas y mínimas de la formación de velos, ... etc. 3 Q .- Estructura celular.- No es un buen caracter diagnóstico aunque como a todas las células tiene un gran interés científico.

Ya hemos dicho que los blastomi-

cetos poseen membrana, a veces rodeada de una sustancia mucosa-gelatinosa que forma en las preparaciones el llamado retículo gelatinoso.

Las células de

los sacaromi-

cetos están provistas de un núcleo de 1 f1 de diámetro aproximadamente, facilmente puesta en evidencia por las coloraciones nucleares.

En las levaduras se encuentran -

también vacuolas y gránulos abundantes sobre todo en las células viejas; las vacuolas son claras refringentes, a veces muy grandes ocupando casi toda la célula; en los gránulos se caracterizan gránulos metacromáticos y basófilos, grasas, etc..

El glicógeno

se encuentra con frecunecia en los sacaromicetos y a veces de tal modo abundante que hace suponer a estas sustancias un importante papel en la nutrición celular.

Pa-

rece que la presencia de glicógeno guarda cierta relación con las de la fermentación alcohólica; escasa en un principio aumenta progresivamente hasta un máximo cuando la fermentación es más activa, después poco a poco desaparece.

Desde luego la for-

ma del glicógeno procede de alimento hidrocarbonado, tales como azúcares, manita, glicerina, dextrina y algunos ácidos orgánicos, según Laurent. geno es un producto intermedio de la fermentación.

Para algunos el glicó-

París opina que el glicógeno es

un producto que se forma cuando la concentración del jugo celular aumenta y sirve para evitar en este jugo un exceso de azúcar, y finalmente es muy general la creencia de i¡de se trata de un alimento de reserva, ya que acumula en las células envejecidas y en las ascas y existe en las ascosporas viniendo utilizado en la germinación de las mismas. 4 Q .- Esporulación.- Ya sabemos que los blastomicetos forman ascas y ascosporas.

Para hacerlas esporular puede seguirse el método de Hansen y otros que -

vaUiOS a indicar, que consisten fundamentalmente en colocar a células jóvenes, vigorosas y con abundantes materiales de reserva en condiciones de deficiente nutrición,

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Diversos estados de desarrollo de las levaduras. a) Gemación, durante la fermentación; b) Es-

-

-

tado de reposo hacia la fermentación; ~) Estados oxidativos; ~ Esporulación. V = vacuola, g = gránulos, F = coágulos de grasa.

Jóvenes esporas de células de levaduras. Vacuolas y gránulo (

:=

Condriosomas )

son buenas, son vistas.

_~o~ ...

ó

~.

~

~

Algunas formas celulares de levaduras Apiculadas, según Ch. Niehaus. ~ y ~

tí picas células asociadas.

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dFormación de c'] e u lares e levaduras de VInO. .

. 1 erentes d e f orm Estados d'f superficiales de levaduras aClones ~=

My-

co d erma; _b-- Hansenula: ~ = Pichia.

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gran aireación y temperatura adecuada.

El método de Hansen consiste en tomar par-

te del depósito de un cultivo puro reciente sobre mosto de cerveza, pasarlo a otro mosto esteril cultivando en él 24 horas a 25 º Y recoger el depósito formado en este segundo cultivo para llevarlo a bloques de yeso esterilizado y bañados en agua esteril. Más sencillamante se observa la esporificación en cultivos sobre agar de carne peptonado y con un 0'25

% de

glucosa; después de 2-3 días a 28 º el cultivo esporifica. Gui-

lIiermond recomienda los cultivos sobre zanahoria, en los cuales la esporificación es lenta pero normal.

La forma, magnitud y aún el número de las esporas ( 1-12 ) no

son constantes en absoluto para todas las especies aunque tienen algún interés para el diagnóstico de algunas de éstas.

En cambio tiene una gran importancia el estudio de-

las condiciones térmicas que regulan la formación de esporas, habiendo demostrado Hansen la constancia de este caracter para las diversas especies. dá algunas indicaciones para algunas principales especies

2 significa ausencia de esporificación

El siguiente cuadro

(.!!. significa horas y .4, días,

).

..

Temperatura 4 º, 6º, 8 º, 10º, 12º, 14 º, 16 º, 18 º, 20º, 22º, 24º, 26 º, 28º, 30º, 3~º, 34 º, 3?º, 38º Sacch.

,

\

\

Cerevisiae

. O . . . . . 10d .... 65h 50h ... 27h . 23h .

\,

Sacch. ElIipsoideus .. O .. lld .. '108h .... 45h . 33h ... 29h ..

oll

20h '.231;1 25h 29h O

'-

~

21h ... 23h . 36'~0 \-

Sacch.

. 3040 \

Pasteurianus 14d .... 7d-5d . 89h . 50h . 35h ... 26h . . . .. 24h. 27h

El modo de germinación es caracter que dá escasos datos diagnósticos. 59 .- Caracteres culturales.- Estos caracteres, tan importantes para la diagnosis y estudio de los esquizomicetos, han sido y son poco utilizados para el estudio de los blastomicetos.

La forma, aspecto y color de las colonias, el poder de liquidar

la gelatina son caracteres, según algunos, inconstantes, variables con el estado fisiológico de la levadura, el caldo de que procede, etc. y variables con pequeñísimas modificaciones del medio de cultivo.

Esto merece estudiarse más pero parece que al exa-

men de las colonias gigantes puede dar datos de algún valor diagnóstico siempre que haya constancia en el medio de cultivo aunque éste caracter por si solo tenga poco -

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valor.

Recordemos que las colonias gigantes se producen dejando caer una gota de -

un cultivo puro sobre un medio sólido. 6 Q .- Nutrición.- Hemos de observar que son distintas las exigencias de los blastomicetos para la nutrición que para la fermentación.

Hay azúcar que no es fer-

mentada y que puede servir perfectamente para la alimentación de un blastomiceto. Así, en ensayos hechos por Laurent en medio mineral, en condiciones de aerobiosis con adición de

10/0

de cada una de las sustancias a estudiar como fuentes -

de carbono, han sido utilizados, si bien con actividades vegetativas muy diversas, algunos acetatos, ácidos láctico, málico, tártrico, cítrico y sus sales alcalinas, la glicerina, la manita, los mono y disacaridos; la asparagina, leucina, la peptona y hasta la albúmina de huevo, etc..

En estas experiencias se ha estudiado solo la posibilidad de tomar

el alimento carbonado de tales sustancias, pero evidentemente los alimentos carbonados de predilección son los azúcares aunque otras sustancias orgánicas (asparragina, por ejemplo) se muestran muy utilizables. Esto ha sido observado para el Saccharomyces cerevisiae solamente y solo para esta especie y en las condiciones en que se operó son estimables tales datos.

El azúcar asimilado por mayor número de especies

es la maltosa y después la glucosa y la fructosa; el asimilado por menos especies es la lactosa.

La sacarosa, rafinosa y arabinosa son alimentos mediocres, dificilmente uti-

lizables. La nutrición nitrogenada puede ser en forma amoniacal u orgánica ( ~­ nas, aminoácidos, amidas ) nunca en forma de nitritos y nitratos.

N o parecen utili-

zables como alimentos nitrogenados las sustancias proteicas, si bien la propiedad de ciertos blastomicetos de liquidar la gelatina, indica la facultad de utilizar algunos alimentos nitrogenados no dializablcs.

Pero la mayor parte de las levaduras industriales

no liquidan la gelatina y en la práctica de las fermentaciones son consideradas como inutilizables los proteicos que pueden ser perjudiciales en algÚn caso por ser excelentes alimentos para otros microorganismos concurrentes. Al tratar de las fermentaciones alcohólicas en la industria completaremos para cada uno de ellos las anteriores indicaciones. La valuación de la actividad vegetativa de la levadura en distintas condiciones de alimentación puede tener en algún caso gran interés práctico: las experiencias pueden hacerse con cultivos en la celdilla de un cuentacélulas empleando muy escaso

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material microbiano en la siembra, para evitar el rapidisimo agotamiento de las materias nutritivas.

Un conteo inicial y recuentos sucesivos a intervalos sucesivos pueden

darnos algunas indicaciones útiles sobre el aprovechamiento de algunos alimentos, pero debe tenerse muy presente que tales experiencias no tienen más que un valor comparativo y restringido por las especiales condiciones en que se opera. 7º.- Poder fermentativo.- No existe

ninguna relación definida entre asi-

mi labilidad y poder fermentativo de un azúcar determinado; con frecuencia un azúcar es perfectamente asimilable y hasta un óptimo alimento y no es en absoluto fermentable por una especie y raza de levadura.

El caso contrario es muy raro, sin embar-

go Lindner y Saito afirman que Sacch Ludwigii, Schizosacch. Pombe y Schizosacch. Mellacei entre otros son capaces de fermentar activamente la glucosa, fructosa y sacarosa sin asimilarlas en cantidades apreciables: estas afirmaciones merecerían ser confirmadas. Es característica de cada especie el modo de actuar sobre determinados azúcares: Hansen ha subdividido así los Saccharomyces en 6 grupos: 1.- Fermentan sacarosa, glucosa,

y maltosa, no la lactosa.

2.- Fermentan sacarosa y glucosa, no la maltosa y lactosa. 3.- Fermentan glucosa

y maltosa, no la sacarosa y lactosa.

4.- Fermentan glucosa, no la maltosa, sacarosa y lactosa. 5.- Fermentan la lactosa. 6.- No producen fermentación alcohólica. La facultad de hacer fermentar la galactosa que está disminuida y hasta anulada en algunos blastomicetos puede hacerse revivir mediante cultivos sucesivos en medios que la contengan, sin que esto suponga variación del poder de fermentación. En las levaduras industriales se suelen distinguir dos tipos:

y levaduras bajas.

levaduras altas

Las levaduras bajas en los líquidos que fermentan se presentan ais-

ladas o en pequeños grupos de células nadando en el líquido o formando depósito en

el fondo y actuan a temperaturas inferiores a 5 º

- 10 º.

Las levaduras altas fermentan los azúcares solamente a temperaturas relativamente elevadas 10

º- 25 º o más; en su multiplicación asumen frecuentemente for-

mas agrupadas en montones ramificados formados por bastantes células, o quedan -

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aisladas; las células de levadura, durante la fermentación flotan en el líquido o son arrastradas por las burbujas de C02 y en la parte superior del líquido que fermenta existe un estrato abundantísimo en levaduras mezclada con

la espuma: es evidente -

que no se trata en este caso de nada parecido a una membrana o velo, propiamente dicho.

Cuando la fermentación decrece en intensidad las células de levadura alta se

aislan y caen al fondo formando el depósito. El diverso modo de agruparse, por gemación, se hace patente muy facilmente examinando a las 24 horas, no más tarde, cultivos unicelulares en gota pendiente: las levaduras altas dan agrupaciones densas muy ramificadas de aspecto rígido: las levaduras bajas, procedentes de una sóla célula dan agrupaciones de menos indiviudos, poco ramificados, flojas y facilmente disgregables.

Pero este criterio morfológico no

tiene, ni mucho menos, un valor absoluto y no permite por si solo, afirmar de que clase de levaduras se trata y lo mismo puede decirse de otros procedimientos entre los cuales el más recomendable es la prueba de la fermentación de la melibiosa ( *) azúcar que parece puede ser solamente fermentada por la levadura baja. Esta distinción entre levadura alta y baja tiene un marcado caracter industrial, más bien que un aspecto científico.

En la industria puede convenir el empleo

de levaduras altas o de levaduras bajas, mientras que éste caracter científicamente considerado no es absolutamente constante y Hansen, mediante modificación de la temperatura del medio en cultivos sucesivos y aún más simplemente con preparación de cultivos monocitogenéticos ha obtenido de levaduras altas y bajas, tipos intermedios y aún más ha transformado levaduras bajas en levaduras altas y aunque para vez y con dificultad ha obtenido la regresión contraria.

8º.- Influencia de los agentes físicos y químicos.- Hemos de atribuir gran importancia a la influencia térmica en el desarrollo, esporulación y formación de velo, datos muy constantes para cada especie.

Así, y a modo de ejemplo, tenemos para -

algunas especies:

( *) La melibiosa es un disacarido ( dextrosa-galatosa ) que procede de la hidrólisis de la rafinosa que da melibiosa y levulosa.

La rafinosa se encuentra en las re-

molachas, trigo, avena, en el mana de alguna especie de eucaliptus, ... etc.

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Temperatura máxima, óptima y mínima para la producción de:

t

GEMACION ·Máxima

Sacch. Cerevisiae

Mínima

ESPORAS

VELO Máxima

Optima

Mínima Máxima

Optima

Mínima

40º

1 - 3º

33 -34º 20 - 22º

6-7º

3S - 37º

30º

9 -1lº

40- 41 º

OºS

33 - 34º 33 - 34º

6 -7º

30-32'S~

2Sº

4-7ºS

34º

OºS

25 - 28º 26 - 28º

3-Sº

29-3105

Sacch. Ellipsoideus Sacch. Pasteurianus

27'Sº Oº5-0º4

Los actuales métodos de diagnosis de los blastomicetos serán seguramente perfeccionados sobre todo estudiando mejor los caracteres culturales para establecer definitivamente o desechar una serie muy grande de subespecies, razas y aún especies solo industrialmente o con escasa base establecidas y que convendría clasificar de una vez.

Los estudios de Hansen y los posteriores de Will, Guilliermond y otros han de-

jado abierto el caminq, pero no términada la labor.

y si esto es así para los blasto-

micetos que producen esporas aún más imperfectos son los conocimientos actuales para aquellos cuya esporulación no es conocida, que corresponden seguramente un enorme número de especies de las que hasta ahora poquísimas han sido seguramente identificadas y descritas: los mismos grupos Tórula y Mycoderma en que se comprenden los de más interés práctico, están establecidos de un modo incierto e insuficiente. Caracteres de los grupos Tórula y Mycoderma.- El nombre de Tórulas es itido univeralmente pero no está así consignado en la clasificación adoptada en la cual figuran adscritos ( los individuos llamados tórulas ) al género Torulopsis. Algunos comprenden solamente en este grupo de las tórulas a las formas típicamente globosas o elípticas, casi siempre con muchas gemaciones pequeñas, globosas, pero, provisionalmente es preferible incluir en este grupo, como lo hace WilI, a todos los blastomicetos que, cualquiera que sea su forma, se distinguen de los sacaromicetos por la falta de esporas, de las mucedináceas por falta de micelio típico, y de los mycodermas por su poder fermentativo que falta en éstos.

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Las tórulas determinan casI sIempre fermentación débil de la glucosa, fructosa, galactosa, sacarosa, maltosa y lactosa, produciendo pequeñas cantidades de alcohol y proporciones muy variables de ácidos que quizás derivan a veces de oxidaciones del alcohol en las vegetaciones superficiales; por otra parte, las tórulas asimilan activamente los lcidos orgánicos ( fórmico, acético, mucínico, málico, tártrica, cítrico) cuando no están en proporciones excesivas.

Dan colonias gigantes de formas muy -

variadas y algunas producen pigmentos ( amarillos, anaranjados, rojos y pardos ). Respecto al género Mycoderma han variado mucho los microorganismos

-

que se comprendían en él: algunos autores atribuian este nombre a todos los blastomicetos que formaban velos, pero la mayor parte de los autores antiguos llamaban mycodermas a muchos esquizomicetos que con la máxima frecuencia se desarrollan en velos ( por ejemplo el llamado Mycoderma aceti de Pasteur, bacterias productoras de ácido acético a partir de los líquidos alcohólicos).

Un estudio algo más deteni-

do ha hecho separar del género Mycoderma a todos los esquizomicetos, a los blastomicetos que tienen esporas, aunque se desarrollen en velos muy frecuentemente ( géneros WiIlia y Pichia ) y a los qne producen fermentación alcohólica ( Tórulas ). Así, y provisionalmente, itiremos para el género Mycoderma los siguientes caracteres: 131astomicetos avidí simas del oxígeno del aire, viven en la superficie de los líquidos alcohólicos sobre los que producen membrana que primero es delgada, opaca incolora y con el tiempo to o de otro color claro.

se hace más gruesa, rugosa, de color blanco, amarillen-

El líquido subyacente suele quedar limpio; pocas veces se

enturbia por elementos celulares de la membrana que depositan lentamente células jóvenes casi siempre cilíndricas trasparentes con gemación casi siempre polar lo que dá un aspecto especial ramificado con ciertas regularidad a las vegetaciones mycodérmicas:

células viejas con diversidad de formas.

En las células de los mycodermas se

observan una o pocas vacuolas y compuestos refringentes. Los mycodermas asimilan la levulosa, y algunos también la glucosa, pero no hacen fermentar ningún azúcar, limitándose a oxidar con producción de ácido. Sufunción más interesante es la de oxidar el alcohol etílico dando C02' H20 y otros productos secundarios ( ácidos volátiles, aldehidos, en cantidad muy variable según las especies). Crecen bien en soluciones minerales en las que el alcohol es el único alimento carbonado. gantcos.

No utilizan los alcoholes superiores, pero si algunos ácidos or-

Pueden encontrar alimentación nitrógenada en las sales amónicas.

Alguna

vez liquidan la gelatina, atacan a los compuestos tánicos ( tanino) y en presencia de

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azufre libre ( y aún combinado) pueden producir pequeñas cantidades de SH2'

Los

más conocidos son los Mycodermas que forman las llamadas flores del vino, que casi siempre debilitan a éste, siendo considerados como productores de enfermedad de los vinos, si bien en ciertos casos ( vinos de .T erez y algunos de Extremadura ) se procura el desarrollo de vegetaciones mycodérmicas por considerar indispensables para la producción del aroma ( ¿aldehido? ) de éstos vinos.

No han sido, sin embargo, estudia-

dos estas vegetaciones y no sabemos si realmente son atribuibles al género Mycoderma como se ite generalmente. Enzimas de levadura.- Las enzimas que se hallan en las levaduras comprenden al menos tres grupos diferentes:

las relacionadas con la respiración; las relacio~a­

da:; con la escisión de azúcares hasta el grado de exosa, por ejemplo, la maltosa y la invertasa; y finalmente, aquellas relacionadas con la fermentación alcohólica. Las enzimas catalizan los cambios químicos complejos que tienen lugar enlas soluciones nutritivas de azúcar.

El que un hidrato de carbono sea o no fermenta-

do o asimilado depende de la naturaleza de las enzimas elaboradas por la levadura,

-

siempre además sean favorables las condiciones para la fermentación y el desarrollo. Los polisácaridos, por lo general, no son fermentados.

La lactosa fermenta por ac-

ción del Saccharomyces fragilis ( S. Kefir ), la levadura del producto lácteo fermentado, Kefir, y por otras pocas levaduras; pero no por el S. Cerevisiae, que representan los tipos de levadura mejor conocidos, y probablemente, más ampliamente distribuidos. Las enzimas de levadura son de dos clases: endoenzimas ( intracelulares)y exozimas ( extracelulares ).

Estas enzimas reaccionan según leyes generales de reac-

ciones de enzimas, pero muestran en cada caso un cierto grado especificidad. Las enzimas de levadura pueden clasificarse en hidrolasas y desmolasas. Las hidro lasas convierten los hidratos de carbono, proteina y ésteres en sustancias más sencillas mediante adición de agua, seguida generalmente por una escisión.

Por ejemplo,

la sacarosa es convertida en una molécula de fmctosa, otra de glucosa y otra de galactosa, por acción de la melibiasa y la sacarosa. El glicógeno es hidrolizado a glucosa, pero no sigue la escisión a la adición de una molécula de agua a la molécula de glicógeno.

Aunque la glicogenasa puede -

com crtir por este procedimiento el glicógeno en glucosa, en determinadas condiciones

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hace marchar la reacción en el sentido contrario.

Así, en general en las enzimas la -

cualidad de catalizar reacciones reversibles, del mismo modo pueden sintetizar compuestos que escindirlos en sus componentes. Las desmolasas son enzimas o complejos de enzimas que intervienen en la respiración y el metabolismo.

La zimasa es una desmolasa de origen intracelular y

nunca o casi nunca pasa a través de la pared de la célula hacia el medio que la rodea. La zimasa no es una enzima simple, sino un complejo de enzimas y coenzimas.

Se ha inventado la palabra holozima para incluir los complejos de zimasa con-

todos sus activan tes.

Se considera que ¡as hexokinasa, óxidoreductasa, enolasa, car-

boxilasa y fosfatasa son algunas de las enzimas de este complejo. El cuadro adjunto resume los datos que se relacionan con algunas enzimas halladas en levaduras, los sub tratos sobre los que actúan y los productos finales que se forman como resultado de esta acción. Coenzimas y activadores.- Para que una enzima actúe adecuadamente puede ser necesaria la presencia de una coenzima, fosfato, magnesio o cualquier otra sustancia.

La acción de la óxido-reductasa requiere la presencia de la cozimasa ( coen-

zima 1 ); la cocarboxilasa es requerida por la carboxilasa, enzima que separa el dióxido de carbono de los ácid~s alfa-cetónicos, como el ácido pirúvico. esencial para la activación de la fosfatasa.

El magnesio es

El glutation es requerido por la metilglio-

x al.

El jugo de la levadura libre de células, que proviene de células trituradas o autolizadas, fermenta el azúcar; pero lo hace más lentamente que las células de levadura, como ha demostrado Buchner.

Si se dializa el jugo de levadura pasándolo a

través de una membrana semipermeable, no producirán fermentación del azúcar ni la porción dializada que ha pasado a través de la membrana ni el residuo que ha quedado en ella.

Pero si se mezclan de nuevo estas dos fracciones, continúa la fermenta-

ción. El residuo, o proporción que no pasa a través de la membrana semipermeable es termolábil, y se destruye por ebullición. no dializables.

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En esta fracción se hallan las enzimas

Tabla 1.

Algunas reacciones tipo C'atalizadas por enzimas Grupo enzimático

Reacción tipo 1.

Hidrólisis-condensación o sustitución RCO-NHR' + H,O RCO-NHR' + R"NH,

~ ~

RCOOH + R'NH, RCO-NHR" + R'NH,

RCO-OR'+H.O ~ RCOOH+R'OH RCO-OR' + R"OH ~ RCO-OR" + R'OH RCO-SR' + H,O ~ RCOOH + R'SH RCO-SR' + R';H ~ RCO-R" + R'SH

Proteinasas, peptidasas y amidasas Esterasas Tiol esterasas

R-PO,H, + H,O R-PO,H,+R'OH R-PO,H, + R'NH,

~ ~ ~

RH + H,PO, RH+R'O-PO,H, RH + R'NH-PO,H,

Fosfatasas y transfosforilasas

R-CH-OR' + H,O

~

RH + HO-CH-OR'

Glicosidasas •

I

I

I!

Transglicosidasas •

2.

R-CfI-OR' + R"H ~ RH + R"-CH-DR' I I I I Fosforolisis-condensación

Fosforilasas •

3.

R-CH-OR' + H,PO, ~ RH + H,O,PO-CH-OR' I I I I Escisión o formación de enlaces C-C RCOOH

H H HO-C-C-OH R R' 4.

~RH+CO, ~

Descarboxilasas

• RCH,OH+R'CHO

Aldolasas

Hidratación-deshidratación y procesos afines H H R,C-C-OH

R

H ~R,C=C+H,O

Hidrasas y enzimas afines (los elementos del H,O o NH, pueden ser substituidos por los de H,S)

R

H H H R,C--C-NH, ~ R,C=C+ NH,

R

5.

R

Oxidación-reducción ~H,+B ~A=BH,

Deshidrogenasas

2Fe'++}0.+2H+ -;.- 2Fe'++H:0 AH, + O, -;.- A + H,O, -

Oxidasas

AH, + H,O, -+ A + 2H,O 2H,O, -;.- 2H,0+0,

*

El tipo de fórmula R-CH-OR' indica un glicósido (Cap. 17). I

Tabla 2. Enzima Alcohol deshidrogenasa

I

AI~unos

a-Amilasa

enzimas cristalinos

Procedencia Levadura FUgado de caballo

Aldolasa

Peroxidasas y catalasas

Músculo (conejo, rata) Cebada Saliva humana Páncreas de cerdo

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Tabla 2. Enzima

Alj:unos enzimas cristalinos

Procedencia

{3-Amilasa

Boniatos

ATP-ácido 1,3-difosfoglicérico-transfosforilasa ATP-ácido fosfopirúvico-transfosforilasa Pulhidrasa carbónica

Levadura

Carboxipeptidasa

Páncreas de bóvido

Catalasa

Hígado de bóvido

Rd.:r.:ncia A. K. Balls y col., 7. Biol. Chem., 173, 9 (1948). T. Bücher, Biochim. et Biophys Acta, 1, 292 (1947).

Músculo de rata Eritrocitos de bóvido

Eritrocitos de bóvido

Quimopapaína

Micrococcus lysodeikticus Canca papaya

cx-Quimotripsina

Páncreas de bóvido

Crotonasa

Hígado de bóvido

Desoxirribonucleasa

Páncreas de bóvido

Enolasa

Levadura

Furnarasa Glutámico deshídrogenasa Gliceraldehído-fosfatodeshidrogenasa Hexoquinasa

Corazón de cerdo Hígado de bóvido

Levadura

Deshidrogenasa láctica Lisozima

Corazón de bóvido Clara de huevo

Papaína

Canca papaya

Penicilinasa

Bacil/us cereus

Pepsina

Estómago de cerdo

Músculo de conejo

Salmón Peroxidasa

Rábano rusticano Leche

Fosforilasa

Músculo de conejo

Pirofosfatasa

Levadura

Renina

Estómago de ternero

Ribonucleasa

Páncreas de bóvido

Transcetolasa

Levadura

Tripsína

Páncreas de bóvido

Ureasa

Soja, canavalia

Fermento amarillo

Levadura

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Cozimasa.- El dializado es termoestable y contiene, además de otras sustancias, cozimasa o coenzima I. Euler y Schlenk han propuesto la siguiente fórmula estructural para la cozimasa o coenzima 1:

NIH2 I

/

HC

"

O

H

I

I

C- C

~

I~HOO~ ~] :H I

t

N+ -C-C-C-C-C-O-P=O

C=C /'

H

O

H

I

t

I

I

H

H

H

H

\

H

H

N = C - NH2 I

HC

"11

.

O

I

C-N 1I 1I 1I

~

N-C-N

CH

~HO~~

H

C-C-C-C-C-O-P=O I

H

H

I

I

I

H

H

H

I

OH

Cozimasa ( Coenzima 1 )

Euler y otros autores creen que la cozimasa es una coenzima portadora de hidrógeno, la cual recoge dos átomos de hidrógeno para formar dihidrocozimasa y cederlos más tarde.

Obra como un intermediario entre dos apodehidrasas en el trans-

porte de hidrógeno desde el sistema donador ( gliceraldehido, ácido fosfórico- ácido fosfoglicérico ) al sistema aceptor ( acetaldehido- alcohol etílico) en la fermentación del etanol. La cozimasa puede prepararse por diálisis de zumo fresco de levadura, contiene unos 0'5 gramos de cozimasa por kilogramo de zumo. La coenzima puede ser aislada de muchos tejidos animales; de muchas plantas y hongos; de ciertas bacterias, principalmente de las que dan origen a ácidos propiónicos y láctico; y de los globulos rojos de la sangre.

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Sistema del ácido adenílico.- El dializado de zumo de levadura contiene también un sistema portador de fosfato que funciona como coenzima. está formado

por adenosinmonofosfato.

Este sistema

Para más detalles veanse los apuntes sobre

fermentación alcohólica. Cocarboxilasa.- Lohmann y Schuster han asignado la siguiente fórmula estructural a la coenzima cocarboxilasa, que es vitamina Bl difosforilada.

el

H = CH I

H3C-C I

I

I

C-CH2-N -C-CH3 I

I

N - C - NH2

I

I

OH I

OH I

CH3-C - CH2- CH2 - O - p - O - P - OH I

o

I

o

Cocarboxilasa ( piro fosfato de aneurina )

La cocarboxilasa es termoestable y se encuentra en el jugo de levadura. Cuando se lava con álcali la levadura de cerveza ésta no puede seguir decarboxilando al ácido pirúvico; pero la adicción de jugo de cerveza hervido hace que el sistema sea activo de nuevo, según los estudios de Anhagen, que llamo" cocarboxilasa " al principio terI11oestable. Reacción fitoquímica.- Las levaduras poseen fuertes propiedades reductoras. Un número relativamente grande de sustancias se reduce en un medio fermentante activo que contenga azúcar y levadura.

Los aldehidos se reducen a sus al-

coholes correspondientes; por ejemplo, acetaldehido, gliceraldehido, furfuraldehido ( furfural ) y benzaldehido se reducen a alcohol etílico, glicerol, furfuralcohol y alcohol bencilico, respectivamente.

las cetonas y dicetonas pueden reducirse a sus alco-

holes secundarios correspondientes; pero la velocidad de reducción es menor que la de los aldehidos. La acción reductora de las levaduras no se limita a los aldehidos y cetonas, pues también reducen el azul de metileno. fre a sulfuro de hidrógeno.

El nitrobenceno pasa a anilina y el azu-

También pueden reducir a otros tipos de sustancias.

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Puede demostrarse fácilmente la reducción añadiendo la sustancia que se quiere reducir a un medio de fermentación que contenga ellO de levadura viva.

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% de

sacarosa y el 10 %