Marcadores Moleculares 162j4r

Marcadores Moleculares • Introdução e Histórico • Descrição de Marcadores • Comparação entre Marcadores Moleculares • Classificação de Marcadores Moleculares • Características do Genoma de Planta • Aplicações – diversidade genética – mapeamento e seleção assistida

INTRODUÇÃO E HISTÓRICO Marcadores Moleculares

Genética • “arte” e seleção inconsciente – da invenção da agricultura até séc. XIX

• 1900s - Descoberta dos princípios genéticos • 1920-50 - Melhoramento genético científico – genética quantitativa e biometria – (fenótipo é previsor ruim do valor genético!)

• 1970-80 - Utilização de marcadores genéticos moleculares

• Sucesso no melhoramento depende da capacidade de distinguir fatores genéticos herdáveis dos ambientais • Marcadores genéticos são unidades herdáveis simples

cromossoma

marcadores

• Polimorfismo de DNA resulta acúmulo de mutações – pontual ou inserção/deleção – macro-rearranjos: translocações, inversões, deleções

Origem do Polimorfismo Molecular 1. Mutações pontuais - SNPs A.

ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT

B.

ATCTCGTGATTATAGTCGTA TAGAGCACTAATATCAGCAT

ex. Sítio EcoRI

2. Pequenas deleções e/ou inserções - InDels A.

ATCTCGTCTAGTCGTA TAGAGCAGATCAGCAT

B.

ATCTCGT---GTCGTA TAGAGCA---CAGCAT

Histórico de Marcadores 1. Karl Sax (1923): propôs método para localização de QTLs ligação entre genes de característica qualitativa (cor de semente) e quantitativa (peso de semente);

Problema: ausência de mutações múltiplas em estoque de elite, baixa viabilidade

2. Hunter & Markert (1957) - marcas bioquímicas desenvolveram isoenzimas em gel de amido

Histórico de Marcadores 3. Hubby & Lewotin (1966) demonstraram que 30% de loci de isoenzimas exibiam polimorfismo em populações selvagens de Drosophila;

4. 1970’s - ferramentas moleculares desenvolvimento de vetores de clonagem; enzimas de restrição; polimerases; ligases; Southern (1977);

Histórico de Marcadores 5. RFLP proposto por Botstein et al. (1980) descrito para humanos

6. PCR proposto por Mullis & Faloona (1987) 7. VNTR por Jeffrey (1987) 8. RAPD por Rafalski et al. (1990)

Histórico de Marcadores 9. SSR em plantas por Akkaya et al. (1992) 10. AFLP por Zabeau & Vos (1993) 11. CAPS por Konieczny & Ausubel (1993)

12. SCAR por Paran & Michelmore (1993) 13. Cho et al. (1999) - SNPs em Arabidopsis

DESCRIÇÃO DOS MARCADORES MOLECULARES

Marcadores Moleculares • • • •

RFLP VNTR (minissatélite) RAPD, AP-PCR, DAF PCR-específico - SSR, ISSR, CAPS, SCARs • AFLP • SNPs

Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP • RFLP examina diferença em tamanho de fragmentos de restrição de DNA específicos • Polimorfismo deriva de mutação pontual, inserção, deleção • Utiliza-se DNA celular total • Requer DNA puro de alto peso molecular

Metodologia de RFLP 1 . Digerir DNA em fragmentos pequenos 2. Separação dos fragmentos por gel eletroforese 3. Transferência de fragmentos de DNA para filtro

Fonte: IPGRI

Metodologia de RFLP 4. Visualização dos fragmentos de DNA – sondas marcadas (32P) ou a frio

5. Análise dos resultados – bandas analisadas para alelos e/ou presença/ausência – diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas

A escolha de sonda/enzima de restrição é crucial Fonte: IPGRI

Digestão de DNA Genômico e Separação em Gel digestão

2 3

DNA Separação em gel

5

4

1 1 2 3 4 5

Transferência para Membrana de Nylon ou Nitrocelulose 2 3 1

4

5

Hibridização em Nylon ou Nitrocelulose

Construção de biblioteca genômica ou de cDNA

mRNA ou DNA

cDNA

Clone cDNA

Biblioteca de cDNA

Eletroforese

Exposição em filme de Raios-X

Hibridização com sonda marcada

Interpretação de resultados 1 1

2

3

4

5

6

2 3 4

5

Sítio alvo para sonda 6

Sítio de restrição Inserção

Fonte: IPGRI

RFLP em Cana de Açúcar

Sorgo

Cana

P1 P2

1:1 3:1

Hibridização com sonda de sorgo

1:1

3:1

Hibridização com sonda de Cana

A

Herança de RFLPs B

6 Kb

8 Kb

F1 8 Kb

6 Kb

F2 6 Kb

8 Kb 6 Kb

8 Kb 6 Kb

8 Kb

Análise de Diversidade e Filogenia por RFLP 5

13

A

B

6 2

C

8

A 13

B

C

8

11 9

6 5

4

2

RFLP: sondas de locos único • DNA Nuclear – biblioteca genômica – biblioteca de cDNA

• DNA Citoplasmático – biblioteca de DNA cloroplástico e mitocondrial

• Sondas de RFLP são: – locos-específica, co-dominante – espécie-específica

RFLP: sondas multi-locus • Repetições em linha (tandem) - útil – encontrada em vários loci – altamente polimórficas

• Sequência de Minissatélite

– VNTR: variable number of tandem repeats – uso em “DNA fingerprinting” – uso de seqüências repetidas de fago M13

Interpretação dos resultados A1A1

A1 A1

A1 A2

A2 A3

A1A2

A2A3

Repetição Sítio de Restrição

Fonte: IPGRI

Vantagens e Desvantagens de RFLP • Reprodutível • Marcadores co-dominantes • Simples • Trabalhoso • Caro • Uso de sondas radioativas* Fonte: IPGRI

Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD • Amplifica seqüências anônimas de DNA usando primers arbitrários – 10 bases com >50% G+C

• PCR com um único primer • Método rápido para detecção de polimorfismos • Marcador dominante • Problemas de reproducibilidade

RAPD AA Aa

aa

AA Aa aa

Interpretação de RAPDs • • • •

Marcadores RAPD são anônimos Dados binários (presença x ausência) RAPD são dominantes (AA = Aa) Problemas de co-migração – mesma banda, mesmo fragmento? – uma banda, um fragmento?

• Questionamento para filogenia – banda homólogas?

PCR com primers arbitrários: acúmulo de siglas!

• RAPD

– Random Amplified Polymorphic DNA

• DAF

– DNA Amplification Fingerprinting

• AP-PCR

– Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction

• MAAP

– Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (sugerido por incluir todas as pequenas variações na técnica) Fonte: IPGRI

Diferenças entre ensaios com primers arbitrários • RAPD – 10mers, gel de agarose corado com brometo

• DAF – 5mers, gel de acrilamida e reação marcada

32P

• AP-PCR – 10mers, gel de acrilamida e reação marcada

32P

Microssatélites

Seta: alelos genoma B