Maldi Tof 1j2mg

TUGAS MIKROBIOLOGI PANGAN LANJUT

MALDI-TOF SPEKTROMETRI MASSA SEBUAH TEKNOLOGI BARU UNTUK DIAGNOSIS DAN IDENTIFIKASI MIKROBA

OLEH: NAMA

: ERIKA ARISETIANA DEWI

NIM

: 156100100111022

PROGRAM MAGISTER TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2015

MALDI-TOF SPEKTROMETRI MASSA : Sebuah Teknologi Baru Untuk Diagnosis Dan Identifikasi Mikroba Neelja Singhal1 , Manish Kumar2 , Pawan K. Kanaujia1 and Jugsharan S. Virdi1* 1 Department of Microbiology, University of Delhi, New Delhi, India, 2 Department of Biophysics, University of Delhi, New Delhi, India

Saat ini cara mengidentifikasi mikroorganisme terbaik adalah menggunakan 16S rRNA 18S rRNA dan sequencing gen. Namun, dalam beberapa tahun terakhir matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) telah muncul sebagai alat yang potensial untuk diagnosis dan identifikasi mikroba. Selama proses MALDI-TOF MS, mikroba diidentifikasi dengan menggunakan sel utuh atau ekstrak sel. Proses ini cepat, sensitif, dan ekonomis dalam hal tenaga kerja dan biaya yang digunakan. Teknologi ini telah siap digunakan oleh ahli mikrobiologi yang telah melaporkan penggunaan MALDI-TOF MS untuk beberapa tujuan seperti, identifikasi type strain dan mikroba, studi epidemiologi, deteksi agen senjata biologis, deteksi patogen air dan makanan, deteksi resistensi antibiotik dan deteksi patogen darah dan saluran kemih dll. Keterbatasan teknologi ini adalah bahwa identifikasi isolat baru hanya mungkin jika database spektral mengandung peptida sidik jari massa strain jenis genera / spesies / sub spesies / strain tertentu. Ulasan ini memberikan ikhtisar tentang status dan aplikasi terbaru dari spektrometri massa untuk identifikasi mikroba. Hal ini juga mengeksplorasi kegunaan teknologi baru yang menarik untuk diagnosis penyakit yang disebabkan oleh bakteri, virus, dan jamur. Pendahuluan Informasi genomik dalam sel mikroba diterjemahkan ke dalam lebih dari 2000 protein, sejumlah besar dapat dipelajari dengan menggunakan proteomik (Wasinger et al., 1995). Diperkirakan bahwa untuk genom yang mengandung kurang dari 1.000 gen, lebih dari 50% dari prediksi proteoma mungkin diidentifikasi dari genom. Demikian pula diperkirakan 10% - 30% proteoma kemungkinan diidentifikasi dari genom yang masing-masing membawa gen ca. 2500 dan ca. 4000 (Jungblut dan Thacker, 2004). Dengan demikian, genom mikroba yang mengandung 600-7000 gen, diprediksi merupakan sistem menengah yang kompleks di mana aplikasi proteomik dapat memberikan pengetahuan tentang bagian penting dari proteoma mikroba ini. Karakterisasi dan diferensiasi dari proteoma mikroba dikembangkan dan berkembang dengan metode pemisahan berbasis gel dan gel bebas protein. SDS-PAGE protein sel utuh, dibantu dengan analisis komputer digunakan dalam beberapa penelitian untuk identifikasi dan klasifikasi mikroorganisme (Vandamme et al., 1996). Ketika dilakukan dalam kondisi standar, teknik ini dilaporkan menjadi cukup berhasil. Identifikasi spesies menunjukkan korelasi yang baik dengan hibridisasi DNA-DNA (Vandamme et al., 1996). Namun, profil protein SDS-PAGE tidak menjadi populer di kalangan ahli mikrobiologi. Ini mungkin dikaitkan dengan: (a) kurangnya database yang luas untuk mengetahui identifikasi mikroorganisme, (ii) persyaratan kondisi yang sangat standar, yang termasuk pertumbuhan mikroorganisme yang tidak diketahui pada media yang identik, standar kondisi elektroforesis, prosedur pewarnaan, dan analisis pola berikutnya, (iii) teknik itu tidak cukup tepat untuk membedakan strain yang sangat mirip. Elektroforesis dua dimensi (2-DE) juga gagal menjadi populer di kalangan ahli mikrobiologi karena metode ini menggunakan tangan yang sangat melelahkan, bahkan setelah ketersediaan produksi gel secara komersial dan software analisis untuk meningkatkan gel (Cash, 2009). Keuntungan dan kerugian dari pendekatan proteomik kuantitatif lainnya telah dibahas di tempat lain (Tiwari dan Tiwari, 2014). Analisis proteome seluler adalah metode yang menempati posisi perantara fenotipikgenotypic dikotomi, sejak produk gen yang mencerminkan fungsi metabolisme protein dianalisis. Berbagai metode yang dimiliki telah digunakan untuk deteksi mikroorganisme dalam set-up mikrobiologi klinis, dengan keuntungan dan kerugian yang telah tercantum dalam tabel 1. Peningkatan menggunakan metode sidik jari DNA telah ditegaskan dalam dua dekade terakhir untuk penerapan dan identifikasi utilitas dan klasifikasi mikroorganisme. Namun, otomatisasi teknologi proteomik, tahun-tahun terakhir ini telah meningkat melalui penggunaan dan potensi untuk sejumlah tujuan seperti, penentuan type strain dan epidemiologi, identifikasi mikroba yang menghuni ekosistem tertentu, deteksi agen perang biologis, deteksi air dan makanan yang mengandung patogen dan deteksi patogen dalam darah dan saluran kemih,

deteksi resistensi antibiotik dll. Ulasan ini memberikan gambaran tentang status dan aplikasi terbaru dari spektrometri massa (MS) untuk identifikasi mikroba dan mengeksplorasi manfaat dari teknologi ini untuk diagnosis penyakit yang disebabkan oleh bakteri, virus dan jamur. Spektrometri Massa Spektrometri massa adalah teknik analisis untuk menentukan struktur kimia di mana senyawa kimia terionisasi menjadi molekul berdasarkan perhitungan massa dari molekul tersebut serta pola fragmentasinya (m/z). Meskipun MS ditemukan pada awal 1900-an dengan ruang lingkup terbatas pada ilmu kimia. Namun, pengembangan electron spray ionization (ESI) dan matriks dibantu matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) di tahun 1980 meningkatkan penerapan MS untuk analisa molekul biologis yang besar seperti protein. Dalam ESI dan MALDI, peptida diubah menjadi ion, baik dengan penambahan, atau menghilangkan lebih dari satu proton. Keduanya didasarkan pada "ionisasi lunak" yaitu metode di mana pembentukan ion tidak menyebabkan hilangnya integritas sampel secara signifikan. MALDITOF MS memiliki kelebihan tertentu dibanding ESI-MS yaitu (i) MALDI- TOF MS menghasilkan ion bermuatan tunggal, sehingga interpretasi data mudah dikomparatif dengan ESI-MS, (ii) untuk analisis oleh ESI- MS, pemisahan sebelum kromatografi diperlukan sedangkan untuk analisis MALDI-TOF MS tidak diperlukan (Everly et al., 2008). Akibatnya, dengan bahan proses yang lengkap dan dengan kecepatan otomatisasi yang tinggi telah membuat MALDI-TOF massa spektrometer adalah pilihan yang jelas untuk analisa proteomik pada skala besar (Ekström et al., 2000). TABEL 1 | Metode deteksi mikroba yang digunakan dalam mikrobiologi klinik. No Metode Deteksi Keuntungan Kerugian 1 Konvensional, kultur  Sensitif  Proses memakan waktu pada media mikrobiologi  Murah yang panjang dan identifikasi dengan  Mungkin membutuhkan uji biokimia waktu 24-48 jam 2 Metode berbasis  Lebih cepat daripada metode  Tidak spesifik, sensitif, dan imunologi konvensional cepat sebagai dasar  Dapat mendeteksi organisme metode deteksi nukleatacid yang mencemari dan  Membutuhkan sejumlah racunnya besar antigen  Dikembangkan hanya untuk sejumlah kecil mikroorganisme 3 Florescent in situ  Deteksi cepat dan identifikasi  Uji dibatasi oleh hybridization (FISH) langsung dari slide smears ketersediaan antigen  Cepat dan kemudahan spesifik untuk deteksi penggunaan metode pewarnaan konvensional dikombinasikan dengan kekhususan metode molekuler 4 Metode berbasis molekular  Pembiakan sampel tidak  Cycler termal yang tepat (i) Real-time diperlukan sangat dibutuhkan PCR  Spesifik, sensitif, cepat, dan  pegawai laboratorium (ii) Multiplexakurat terlatih diperlukan untuk PCR  Sistem tabung tertutup melakukan tes mengurangi risiko kontaminasi  Dapat mendeteksi patogen secara bersamaan 5 Sequen/urutan DNA  sequen 16S rDNA dan 18S  Diperlukan pegawai

6

Mikroarray

7

Uji loop-mediated isothermal amplification (LAMP)

8

Uji metagenomic

9

MALDI-TOF MS

rDNA adalah standar utama laboratorium terlatih dan  Dapat mengidentifikasi interpretasi software yang kuat kondisi dan pemilihan  Mahal mikroorganisme  Tidak cocok untuk penggunaan klinis rutin  Skala sistem penyaringan  Mahal  pegawai laboratorium besar untuk diagnosis simultan dan deteksi terlatih diperlukan patogen  Dapat menghasilkan salinan  Dikembangkan untuk hanya besar DNA dalam waktu sejumlah kecil kurang dari satu jam mikroorganisme  Mudah digunakan  Tidak diperlukan peralatan canggih  Berguna untuk deteksi acak  Data akuisisi dan analisis patogen data memakan waktu  pegawai laboratorium terlatih diperlukan  Cepat  Biaya awal yang tinggi dari  Tepat peralatan MALDI-TOF  Lebih murah daripada metode deteksi molekuler dan berbasis imunologi  pegawai laboratorium terlatih tidak diperlukan

MALDI – Prinsip dan Metodologi Sampel yang akan dianalisis oleh MALDI MS disiapkan dengan mencampur atau melapisi dengan larutan energi dari absorben dan senyawa organik yang disebut matriks. Ketika matriks mengkristal pada pengeringan, sampel yang terperangkap dalam matriks juga mengkristal. Sampel dalam matriks otomatis terionisasi dengan sinar laser. Desorpsi dan ionisasi dengan sinar laser menghasilkan ion tunggal terprotonasi dari analit dalam sampel. Ion-ion terprotonasi kemudian dipercepat pada fixed potensial, di mana sampel terpisah satu sama lain atas dasar rasio massa-analit bermuatan (m / z). Analit bermuatan kemudian dideteksi dan diukur dengan menggunakan perbedaan jenis analisis massa seperti analisis massa quadrupole, analisa perangkap ion, analisis time of flight (TOF) dll. Untuk aplikasi mikrobiologi analisis massa terutama menggunakan TOF. Selama analisis MALDI-TOF, rasio m / z dari ion diukur dengan menentukan waktu yang diperlukan untuk untuk menghantarkan sepanjang tabung flight. Beberapa analisis TOF menggabungkan cermin ion di bagian belakang tabung flight, yang berfungsi untuk memantulkan kembali ion melalui tabung flight ke detektor. Dengan demikian, cermin ion tidak hanya meningkatkan panjang tabung flight, juga mengoreksi perbedaanperbedaan kecil energi antara ion (Yates, 1998). Berdasarkan informasi TOF, karakteristik spektrum yang disebut peptide mass fingerprint (PMF) dihasilkan untuk menganalisa sampel (Gambar 1).

Identifikasi mikroba dengan MALDI-TOF MS dilakukan baik dengan membandingkan PMF organisme yang tidak diketahui dengan PMFs terkandung dalam database, atau dengan cara mencocokkan massa biomarker organisme yang tidak diketahui dengan database proteome. Pencocokan PMF, spektrum MS dari isolat mikroba yang tidak diketahui dibandingkan dengan MS spektrum isolat mikroba yang diketahui dalam database. Untuk identifikasi mikroba tingkat spesies, digunakan berbagai type massa m / z 2-20 kDa, yang mewakili protein terutama ribosom bersama dengan beberapa turunan protein. Pola karakteristik protein ribosom sangat melimpah, yang mewakili sekitar 60-70% dari berat kering sel mikroba, di kisaran massa 2-20 kDa (Murray, 2012) digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme tertentu dengan mencocokkan pola PMF dengan PMFs protein ribosom yang terdapat dalam database. Dengan demikian dalam banyak kasus untuk spesies dan level strain, identitas mikroorganisme dapat dibentuk ke genus (Fagerquist et al.,2010). Pendekatan ini banyak digunakan dalam identifikasi mikroba karena sederhana dan dapat dengan mudah diadopsi dalam laboratorium diagnostik mikroba, dibantu oleh ketersediaan banyak perpustakaan PMFs organisme komersial. Identifikasi mikroba dengan mencocokkan biomarker massa dengan massa molekul protein dengan memperkirakan urutan/sequen genom tidak populer dilakukan di laboratorium diagnostik mikrobiologi, karena membutuhkan pengetahuan tentang urutan/sequen genom lengkap dari suatu organisme sebelum prediksi database massa molekul protein bisa dibuat. Meskipun, kondisi kultur mungkin memberikan efek fisiologi pada mikroba dan profil ekspresi protein (Welker, 2011) tetapi tidak berpengaruh pada identifikasi mikroba oleh MALDITOF MS. Valentine et al. (2005) kultur tiga bakteri spesies pada empat media kultur berbeda dan ditemukan identifikasi mikroba dengan kondisi independen kultur oleh MALDI-TOF MS. Kelompok penelitian lain (Carbonnelle et al., 2007) juga melaporkan bahwa kedua kondisi kultur dan waktu kultur tidak memberi pengaruh pada identifikasi mikroba oleh MALDI- TOF MS. Sejumlah senyawa organik telah digunakan sebagai matriks pada MALDI-TOF MS tetapi untuk aplikasi mikrobiologi, a-siano-4-hydroxycinnamic asam (CHCA), 2,5-dihidroksi asam benzoat (DHB), dan 3,5-dimetoksi-4-hydroxycinnamic asam (acid sinapinic) paling banyak digunakan. Larutan matriks terdiri dari air dan campuran organik pelarut yang mengandung ethanol / methanol atau asetonitril dan asam kuat seperti tri fluoro asam asetat (TFA), yang melarutkan matriks. Pelarut menembus dinding sel mikroorganisme dan ekstrak protein intraseluler keluar. Ketika pelarut menguap, 'co-kristalisasi' molekul protein dan senyawa selular lainnya terperangkap dalam larutan matriks (Horne ff er et al., 2001). Proses persiapan sampel untuk identifikasi mikroba dengan MALDI-TOF MS tergantung pada sumber dari mana terisolasinya, atau pada sifat kimia dari konstituen pada dinding sel nya. Peneliti telah mengevaluasi perbedaan metode persiapan sampel untuk membedakan kelompok mikroorganisme. Beberapa mikroba mungkin diidentifikasi langsung oleh MS, yang disebut profil langsung sel (pro filing), sementara untuk beberapa sel lisat lain atau ekstrak sel mentah harus disiapkan. Dalam identifikasi sel secara langsung, koloni tunggal mikroorganisme diambil dan dilihat langsung ke plate sampel dan segera dilapisi dengan larutan matriks. Bakteri gram negatif seperti Neisseria spp. (Ilina et al., 2009), Yersinia spp. (Stephan et al., 2011), dan Vibrio spp. (Eddabra et al., 2012) yang diidentifikasi oleh MALDI-TOF MS menggunakan profil sel langsung. Persiapan ekstraksi mikroba dengan asam format (FA) dikabarkan meningkatkan kemampuan MALDI-TOF MS dalam mengidentifikasi spesies Gram-positif. Penelitian telah melaporkan bahwa ekstraksi persiapan yang diperlukan untuk identifikasi bakteri Gram-positif dengan MALDI-TOF MS, tetapi tidak untuk bakteri Gram negatif (Alatoom et al, 2011;. Sa ff ert et al,

2011.). Ekstraksi persiapan mikroba dengan asam format juga digunakan untuk persiapan sampel spesies bakteri gula-non fermentasi (Mellmann et al., 2008) dan Staphylococcus spp. (Dubois et al., 2010). Karena sifat kompleks dari dinding sel aerobik maka actinomycetes, Nocardia dan mycobacteria memerlukan prosedur pengolahan khusus sebelum analisis MALDI-TOF. Verroken dkk.(2010) menjelaskan prosedur modifikasi untuk identifikasi dari Nocardia spp. oleh MALDITOF MS. Bakteri dipecah dalam air mendidih, diikuti oleh presipitasi etanol dari protein. Protein yang diendapkan, dikeringkan, disuspensi dalam 70% asam format dan asetonitril dan dianalisis oleh MALDI-TOF MS. Para peneliti telah melaporkan perbedaan metode untuk persiapan sampel untuk identifikasi mikobakteri oleh MALDI-TOF MS, mulai dari profil bakteri untuk treatmen dengan asam format, keselamatan menjadi perhatian utama bagi penelitian. EI Khéchine et al. (2011) menjelaskan prosedur yang dikombinasikan inaktivasi dan metode pengolahan. Koloni mikrobakteri dikumpulkan dalam tabung secrew yang mengandung air dan 0,5% Tween 20 yang diinaktif dengan pemanasan pada suhu 95ºC selama 1 jam. Sampel tidak aktif disentrifugasi dan divortex dengan kaca beads untuk mengganggu dinding sel mikobakteri, pelet yang dihasilkan kembali disuspensikan di asam format, asetonitril, dan disentrifugasi lagi. Akhirnya, supernatan disimpan ke plat target MALDI dan dilapisi dengan matriks. Seperti dalam bakteri, berbagai metode pengolahan sampel telah diselidiki untuk identifikasi ragi oleh MALDI-TOF MS, dari mulai ekstraksi persiapan dengan asam format yang dilaporkan paling cocok (Stevenson et al, 2010b;. Theel et al., 2012). Cassagne dkk. (2014) mengevaluasi lima metode untuk persiapan sampel untuk hifa jamur dan spora. Mereka akhirnya merancang protokol dimana jamur yang dibudidayakan pada sabouraud gentamisinkloramfenikol agar selama 72 jam pada suhu 27◦ C, diekstraksi dengan asam format berikut inkubasi dalam etanol. Asetonitril ditambahkan, campuran disentrifugasi dan supernatan digunakan untuk analisis MALDI-TOF MS. Lau dkk. (2013) melaporkan metode berdasarkan mekanisme lisis untuk persiapan sampel dari jamur hifa dan spora. Spesimen kecil dari isolat jamur disuspensikan dalam etanol dan zirkonia-silika beads, di vortex kembali dan disentrifugasi. sampel kembali disuspensi dengan 70% FA, di vortex kembali, dan disentrifugasi. Supernatan digunakan untuk analisis selanjutnya oleh MALDI-TOF MS. Kedua metode tersebut dilaporkan memberikan hasil yang baik dalam studi masing-masing. Analisis sel utuh anggota genus Penicillium menghasilkan sedikit spektrum MALDI, tetapi disuspensi kembali dengan konidia dan spora pada tri fluoroacetic asam-asetonitril dan dikacaukan dengan diskriminasi spesies pada glass beads dengan akurasi 100% (Hettick et al.,2008a). Penemuan matriks yang sesuai, penggunaan seluruh/sel utuh untuk merekam PMF mikroba dalam kisaran massa khas (m / z) 2-20 kDa, diikuti oleh ketersediaan database yang didedikasikan untuk identifikasi mikroba telah membuat MALDI-TOF MS menguntungkan sebagai alternatif untuk identifikasi mikroba. Yang pertama sistem MALDI-TOF MS mampu mengidentifikasi mikroba, disebut "MALDI Biotyper "dikembangkan oleh Bruker Daltonics. MALDI Biotyper terdiri dari dasar platform MALDI-TOF, operasi analisis dan software, database didalamnya dan metode yang sederhana untuk persiapan ekstraksi/sampel (Seng dkk., 2009). Software dan database yang terintegrasi dengan mudah dengan instrumen Bruker MALDI-TOF dan operasi yang terkait dan analisis software. Sistem ini juga memungkinkan untuk gradasi dengan menyediakan pilihan untuk menambahkan organisme pada perpustakaan internal. Selain itu platform MALDI untuk identifikasi mikroba juga diperkenalkan oleh Shimadzu bekerjasama dengan bioMerieux. Shimadzu menyediakan instrumentasi dan perangkat lunak analisis "Launchpad," sementara bioMerieux menyediakan dan mempertahankan Database terpusat, "SARAMIS" yang bisa terus diperbarui. Kemudian, Andromas memperkenalkan perbedaan jenis database dan software untuk identifikasi bakteriologis yang kompatibel dengan kedua Bruker dan instrumen Shimadzu (Emonet et al., 2010). Terobosan terbesar dalam pengembangan MALDI-TOF MS datang dengan persetujuan peraturan untuk identifikasi bakteri dan jamur di laboratorium mikrobiologi klinis. Dalam 2 tahun terakhir, sistem MALDI Biotyper CA (Bruker Daltonics Inc) telah disetujui oleh US Food dan Drug istration (FDA) untuk identifikasi kultur bakteri dari spesimen manusia (in vitro diagnosis). Demikian pula, VITEK R MS (bioMerieux Inc) telah disetujui oleh FDA AS untuk identifikasi kultur bakteri dan ragi (Patel, 2015). Daftar mikroorganisme yang disetujui untuk identifikasi untuk sistem unik individual (Patel, 2015). MALDI-TOF MS adalah identifikasi pertama yang disetujui untuk penggunaan klinis di Cina pada tahun 2012 ketika bioMerieux Sistem VITEK MS telah disetujui oleh FDA Negara China untuk tujuan in vitro diagnostik (IVD) (Luo et al., 2015). Kemudian, FDA Negara

China juga menyetujui Sistem Bruker IVD MALDI Biotyper untuk identifikasi mikroorganisme yang diisolasi dari spesimen manusia. Database organisme adalah komponen kunci dari platform MALDI komersial. Mereka terus meningkat dalam ukuran dan secara teratur diperbarui oleh produsen dengan penemuan spesies mikroba baru dan penjelasannya. Keduanya, Bruker dan sistem Shimadzu mempunyai koleksi organisme yang reperesentatif di database mereka dan menghasilkan hasil positif yang sebanding, dengan tingkat kesalahan sangat rendah (Carbonnelle et al., 2012). Dengan beberapa pengecualian, isolat jarang tidak dapat diidentifikasi oleh perangkat ini. Dalam studi identifikasi berbasis MALDI, beberapa organisme tidak bisa diidentifikasi. Kegagalan ini disebabkan oleh organisme yang tidak termasuk dalam database awal karena kesalahan metodologis (Carbonnelle et al., 2012). Kelemahan penting dari software dan database dengan hak milik adalah aksesibilitas mereka yang terbatas untuk para peneliti swasta karena biaya tinggi. Namun demikian, beberapa kelompok penelitian telah mengembangkan beberapa software open-source dan database yang tersedia secara bebas untuk masyarakat ilmiah menggunakan beberapa nama ini, mMASS, Mass-Up, pkDACLASS, MALDIquant, SpectraBank, BIOSPEAN, dll (Strohalm et al.,2008; Ndukum et al, 2011.; Böhme et al, 2012.; Gibb danStrimmer, 2012; Raus dan Šebela, 2013). Aplikasi pada Diagnosis Mikroba MALDI-TOF MS pada Bakteriologi klinis Diagnosis infeksi bakteri secara konvensional pada fluida tubuh dilakukan atas dasar biokimia dan profil metabolik yang membutuhkan waktu 24-48 jam untuk mengidentifikasi spesies bakteri. Sementara itu, pasien diberikan antibiotik empiris, yang kadang-kadang tidak pantas. Laboratorium mikrobiologi klinik membutuhkan metode yang efektif, cepat dan handal serta biaya yang rendah, untuk identifikasi patogen potensial dalam sampel klinis sehingga terapi antimikroba yang tepat dapat dimulai dari awal. Sejumlah peneliti telah menunjukkan bahwa MALDI-TOF MS dapat digunakan untuk identifikasi awal bakteri dalam kultur darah, infeksi saluran kemih (ISK), fluida cerebrospinal, infeksi saluran pernapasan, sampel tinja dll. Banyak penelitian telah menunjukkan bahwa MALDI-TOF MS menyamai atau bahkan melampaui metode diagnostik konvensional dalam kecepatan dan akurasi dalam mendeteksi infeksi aliran darah (La Scola dan Raoult, 2009; Stevenson et al, 2010a.; Foster, 2013; Haigh et al, 2013.; Tadros dan Petrich, 2013). Beberapa penelitian menyarankan bahwa tambahan praperawatan fluida tubuh oleh amonium klorida (Prod'hom et al., 2010), asam format (Christner et al.,2010), atau inkubasi jangka pendek pada media padat (Idelevich et al., 2014) agar lebih ditingkatkan untuk potensi diagnostik MALDI-TOF MS. Ketika metode konvensional digunakan untuk mengidentifikasi patogen dari saluran urin dengan diagnosis menggunakan ISK dibandingkan dengan MALDI-TO MS berdasarkan sistem identifikasi, ditemukan bahwa MALDI-TOF MS memerlukan waktu pemrosesan minimal dan bahkan identifikasi bakteri dari sampel urine didapati lebih dari dua uropathogens (Ferreira et al, 2010;.. Köhling et al, 2012; Burillo et al., 2014). Beberapa peneliti telah menyarankan prosedur yang melibatkan perbedaan sentrifugasi sampel urin (Rossello et al., 2014) atau di infiltrasi (Demarco dan Burnham,2014) untuk lebih meningkatkan sensitivitas klinis dan berdasarkan perputaran saat diagnosis menggunakan MALDI-TOF MS ISK. Diagnosis infeksi diare di laboratorium biasanya dilakukan oleh kultur dan identifikasi bakteri dalam sampel tinja. Ini adalah proses yang memakan biaya dan dibutuhkan waktu 3-5 hari untuk mendeteksi dan mengidentifikasi bakteri patogen enterik. Dia et al. (2010) melakukan studi banding dari identifikasi oleh MALDI-TOF MS dibandingkan metode fenotipik biasa untuk identifikasi koloni yang mencurigakan dari sampel tinja. Mereka menemukan bahwa seluruh prosedur untuk identifikasi oleh MALDI- TOF MS, mulai dari persiapan smear untuk pelaporan hingga hasil final akan selesai dalam waktu 30 menit, sehingga memperpendek waktu penyelesaian tes yang sebelumnya 2-3 hari. Bakteri meningitis adalah neurologis darurat. Awal diagnosis sangat penting untuk inisiasi cepat antimikroba untuk terapi yang tepat. MALDI-TOF MS telah digunakan untuk deteksi langsung bakteri penyebab meningitis pada fluida cerebrospinal (Segawa et al.,2014). Ini juga telah digunakan untuk identifikasi cepat dari atipikal, organisme lingkungan gram negatif dan patogen saluran pernapasan kronis yang menginfeksi pasien dengan cystic fibrosis (Alby et al, 2013;.. Baillie et al, 2013). Baru-baru ini, penerapan baru MALDI-TOF MS ditunjukkan oleh

Guembe dkk. (2014) yang melaporkan bahwa MALDI-TOF MS dapat melakukan kultur yang lebih baik daripada metode konvensional dalam diagnosis catheter yang terkait infeksi aliran darah. Bakteri Yang Terbawa oleh Air dan Makanan Identifikasi cepat pada mikroorganisme patogen penting untuk memastikan keamanan dan kualitas air dan produk makanan. MALDI-TOF MS telah terbukti berguna untuk deteksi dini bahaya bakteri yang mungkin mencemari air minum. Genus Aeromonas pada permukaan air saat ini terdiri dari 17 spesies, yang tujuh dapat menyebabkan wabah yang terbawa oleh air . Donohue dkk. (2007) menggunakan tanda m/z dari strain yang dikenal Aeromonas untuk menetapkan isolat spesies lingkungan yang tidak diketahui. Hasil penelitian mereka menunjukkan bahwa MALDI-TOF MS cepat dan akurat mengklasifikasikan spesies yang tidak diketahui dari genus Aeromonas, yang cocok untuk pemantauan lingkungan. MALDI-TOF MS juga telah berhasil diterapkan pada mikrobiologi makanan untuk berbagai keperluan seperti identifikasi dan klasifikasi bakteri asam laktat dalam makanan fermentasi (Nguyen et al., 2013), deteksi bakteri yang terlibat dalam pembusukan susu dan daging babi (Nicolaou et al ., 2012), identifikasi bakteri yang diisolasi dari susu sapi perah (Barreiro et al., 2010), identifikasi bakteri yang hadir dalam probiotik dan yoghurt (Angelakis et al., 2011), identifikasi bakteri patogen yang mengkontaminasi bubuk formula untuk makanan bayi (. Stephan et al, 2010), karakterisasi biogenik bakteri yang memproduksi amina, yang bertanggung jawab pada keracunan makanan (Fernández-ada et al, 2010) dan untuk identifikasi agen bakteri gastroenteritis yang terbawa oleh seafood (Hazen et al, 2009.; Böhme et al., 2010, 2011). Bakteriologi pada lingkungan Tes berdasarkan sifat biokimia biasanya gagal untuk mengidentifikasi mikroba yang diisolasi dari sampel lingkungan, karena keragaman mikroba di habitat ini sangat besar (Torsvik et al., 2002). Berbagai penelitian telah menunjukkan bahwa seluruh sel MALDI-TOF MS dapat digunakan sebagai alat yang efisien untuk mengidentifikasi dan mengkarakterisasi isolat yang berasal dari ekosistem spesifik. Para peneliti telah melaporkan penggunaan MALDI-TOF MS dalam identifikasi mikroba yang diisolasi dari lumpur limbah (Ruelle et al., 2004), untuk pengelompokan bakteri yang diisolasi dari spons laut ke dalam kelompok proteotaxanomic (Dieckmann et al., 2005) dan untuk mengidentifikasi bakteri yang mendiami tanah yang terkontaminasi oleh polychlorinated biphenyl (Uhlik et al., 2011). Kelompok penelitian lain melakukan analisis MS MALDI-TOF yang diolah dari fraksi sampel lingkungan. Mereka memperoleh regangan-spesifik spektrum yang membantu dalam pengelompokan aerobik dan halofilik prokariota ke dalam kelompok fenotipik dengan taksa yang berbeda. Mereka menyarankan bahwa, jika perbedaan kondisi kultur yang tidak radikal, terlepas dari usia atau kualitas kultur, MS mencerminkan ulang spektrum mikroba dengan takson spesifik dan dijamin menghasilkan identifikasi sifat fenotip (Munoz et al., 2011). Dalam studi lain MALDI-TOF MS digunakan untuk membedakan spesies bakteri dari keluarga Rhizobiaceae dan membaginya dalam tiga generasi, spesies bakteri ini membentuk simbiosis atau interaksi saprophytic dengan kelompok tanaman. Database dibuat bagi yang termasuk type strain spesies ini dan divalidasi dengan mengidentifikasi semua strain rhizobial yang diisolasi dari nodul dan tumor (Ferreira et al., 2011). Deteksi dan Identifikasi Agen Perang Biologi Identifikasi mikroba yang cepat dan handal diperlukan sebagai agen bioterorisme yang menimbulkan ancaman, tidak hanya untuk memerangi serangan biologis, tetapi juga untuk mencegah wabah alam yang disebabkan oleh organisme ini. Secara konvensional, organisme yang menimbulkan ancaman yang berat sebagai agen bioterorisme telah diidentifikasi oleh fenotype, genotype, dan identifikasi sistem imunologi yang lambat, rumit dan menimbulkan risiko yang signifikan untuk personil laboratorium. Baru-baru ini berbagai peneliti melaporkan MALDI-TOF MS sebagai pendekatan sederhana, cepat dan dapat diandalkan untuk mengidentifikasi organisme yang sangat patogen seperti Brucella spp, Coxiella burnetii, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, dan Y. pestis (Shaw et al, 2004;.. Pierce dkk ., 2007; Lasch et al, 2009;.. Ayyadurai et al, 2010;. Seibold et al, 2010;. Lista et al, 2011;. Vranakis et al, 2013).

Pekerjaan lebih lanjut sedang dilakukan untuk mengembangkan MS-protokol yang aman dan kompatibel untuk inaktivasi sel vegetatif dan organisme spora yang sangat patogen, yang dapat diintegrasikan ke laboratorium mikrobiologi. Lasch dkk. (2008) mengusulkan tri fluoro asam asetat (TFA) berdasarkan inaktivasi protokol untuk sel vegetatif dan spora dari organisme patogen, tapi Couderc dkk. (2012) menemukan bahwa untuk isolat Yersinia, inaktivasi menggunakan etanol secara signifikan menghasilkan spektrum MALDI-TOF MS dengan kualitas tinggi dari inaktivasi TFA. Jeong et al. (2014) melaporkan langsung pada situs MALDITOF MS yang memungkinkan mendeteksi jumlah bahan yang tinggi dan identifikasi dari Bacillus aerosol spora, tanpa proses pre treatment. Spora dari Bacillus spp. langsung terlihat pada plate target MALDI dan plate kiri untuk udara-pengeringan, sampel kemudian dilapisi dengan larutan matriks. Setelah larutan matriks udara kering, maka sampel akan terlihat dan dianalisis oleh MS (Jeong et al., 2013, 2014). MALDI-TOF MS juga telah terbukti berguna untuk deteksi toksin protein, seperti enterotoksin staphylococcal B, neurotoksin botulinum, Clostridium perfringens epsilon toksin, toksin shiga dll yang dapat digunakan sebagai agen potensial untuk bioterorisme saat dikirim melalui rute aerosol (. Kull et al, 2010; Alam et al, 2012.). Dalam perang biologis deteksi racun dari aerosol diperlukan untuk memulai penanggulangan medis. Alam dkk. (2012) mengembangkan metode sederhana pengolahan sampel untuk identifikasi protein racun dengan metode MALDI-TOF/TOF MS. Nebulizer digunakan untuk menghasilkan aerosol yang dikumpulkan menggunakan kolektor siklon. Data MS tandem dengan informasi dari urutan peptida digunakan untuk mendeteksi racun yang berasal dari organisme dari setiap lokasi geografis. Deteksi Resistensi Antibiotik pada Bakteri MALDI-TOF MS telah menunjukan hasil file PDF yang mampu membedakan garis keturunan dari methicillin-resistant S. aureus strain (Wolters et al., 2011). Dalam kondisi eksperimental yang hati-hati, telah menunjukan subtyping yang berguna untuk methicillin resistant strain S. aureus (Croxatto et al., 2012). Demikian pula, MALDI-TOF MS telah terbukti sangat bermanfaat dalam mengidentifikasi vankomisin yang tahan terhadap enterococci (Gri FFI n et al., 2012; Nakano et al., 2014). Wang et al. (2014) menyarankan bahwa MALDI-TOF MS dapat digunakan sebagai alat skrining untuk membedakan vankomisin-resistan strain Enterococcus faecium dari vankomisin-susceptible strain E.faecium Modus yang paling umum dari resistensi mikroba untuk beta-laktam, kelas terbesar antibiotik, adalah hidrolisis enzimatik mereka dengan beta-laktamase. Produksi β-laktamase terdeteksi oleh MALDI-TOF MS menggunakan 'massa spektrometri β-laktamase (MSBL) assay. Dalam pengujian ini, larutan buffer antibiotik dicampur dengan kultur bakteri dan diinkubasi. Reaksi campuran supernatan disentrifugasi dan diaplikasikan pada analisis MALDI-TOF MS. Para produsen β-laktamase menonaktifkan cincin β-laktam dari antibiotik dengan penambahan residu air. Pergantian massa pada non-hidrolisis dan bentuk dihidrolisis dari antibiotik memastikan ada atau tidak adanya β-laktamase yang diproduksi bakteri. Pengujian assay MSBL telah diterapkan untuk deteksi resistensi terhadap beta-laktam antibiotik seperti penisilin, ampisilin, piperasilin, ceftazidime, sefotaksim, ertapenem, meropenem, dan imipenem. Peneliti menggunakan uji MSBL telah berhasil mendeteksi β-laktamase organisme seperti Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanni, Citrobacter freundii, Enterobacter cloaceae, Salmonella spp. dll (. Hrabák et al, 2011; Hoo ff et al, 2012;.. Sparbier et al, 2012a;. Kostrzewa et al, 2013). Mengingat keakuratan resistensi deteksi dengan MSBLs, dilanjutkan inovasi dan perbaikan dalam hal kecepatan deteksi resistensi dan memperluas deteksi untuk kelas yang lebih baru dari antibiotik β-laktam dengan tes MSBL adalah yang diinginkan. Baru-baru ini, Johansson et al. (2014) mengembangkan metode MALDI-TOF MS untuk mendeteksi dan verifikasi dari produksi carbapenemase pada bakteri anaerob, Bacteroides fragilis selama 2,5 jam. Hoyos-Mallecot dkk. (2014) mengevaluasi Metode MALDI-TOF MS untuk identifikasi dan perbedaan dari carbapenemase untuk memproduksi strain klinis Enterobacteriaceae dan P. aeruginosa dari Metallo-β-laktamase strain. Hart et al. (2015) melaporkan strategi modifikasi untuk deteksi biomarker resistensi antibiotik di strain klinis E. coli menggunakan MALDI-TOF MS, mereka menyarankan bahwa jangan menggunakan sel bakteri utuh untuk MS, kompartemen periplasmic harus diekstrak (karena β-laktamase terletak di periplasma); dilarutkan dengan tripsin, dipisahkan oleh nano-LC sebelum analisis MALDI-TOF MS. Dengan menggunakan pendekatan ini mereka melaporkan

urutan peptida biomarker untuk beberapa kelas β-laktamase seperti kelompok CTX-M-1 memperpanjang spektrum β-laktamase, β-laktamase TEM, VIM sebuah Metallo-β-laktamase dan CMY-2 sebuah β- ampC laktamase. Selain menggunakan pendekatan ini mereka juga mendeteksi peptida spesifik aminoglikosida untuk memodifikasi enzim Kan-R. Mirip dengan beta-laktam, resistensi mikroorganisme untuk aminoglikosida terutama karena modifikasi enzimatik antibiotik oleh bakteri acyltransferases, adenyltransferase, dan phosphotransferases. Sejak enzim ini menunjukkan perbedaan istimewa untuk substrat CoA pada aminoglikosida, belum memungkinkan untuk membangun pengujian menyeluruh untuk mendeteksi resistensi aminoglikosida berbasis MS. Selanjutnya upaya untuk mengembangkan dan standarisasi MALDI-TOF MS untuk deteksi resistensi aminoglikosida di laboratorium masih berlangsung. Taksonomi dan Type Strain Bakteri Klasifikasi konvensional bakteri telah dilakukan pada biokimia dasar, metabolisme dan sifat antigenik. Namun, spesies mikroba diidentifikasi terutama atas dasar informasi genomik. Sequencing dari 16Sr DNA dianggap sebagai 'standar emas,' karena itu hadir dalam setiap prokariota dan memungkinkan rekonstruksi dari filogeni global (Woese et al, 1990;. Stacke Brandt dan Goebel, 1994; Pace, 1997). Kebanyakan metode fingerprinting DNA, tidak berkorelasi filogenetis dan gagal untuk memberikan informasi mengenai hubungan evolusi antara teknik berbagai spesies. Teknik genomic seperti amplified fragment length polymorphism (AFLP), pulse-field gel elektroforesis (PFGE), dan multilocus sequencetyping (MLST) digunakan untuk sub type bakteri untuk tujuan epidemiologi. Meskipun pengurutan16S DNAr adalah cukup untuk menetapkan isolasi genus atau spesies, dalam kebanyakan kasus itu tidak cukup untuk type halus, misalnya, studi epidemiologi. PFGE, dapat diterapkan untuk type kelarutan tinggi, tetapi pada umumnya tepat untuk digunakan pada genus atau spesies mikroorganisme (O'Learyetal., 2011). Proteomik mewakili aspek fungsional genomik dan dapat digunakan sebagai alat taksonomi. Gel berbasis protein untuk profil seluruh sel mungkin sangat rumit dan memakan waktu sama sepert setiap teknik genomik lainnya. Di sisi lain MALDI-TOF MS untuk sel utuh atau berdasarkan type sel PMF secara keseluruhan adalah metode cepat dan sensitif untuk identifikasi bakteri. Dalam banyak kasus ditunjukkan memiliki kelarutan dan reproduktifitas yang lebih baik daripada gel berdasarkan protein atau teknik fingerprinting DNA (van Baar, 2000; Fenselau dan Demirev, 2001; Lay, 2001). Sejumlah penelitian menunjukan MALDI-TOF MS adalah teknik yang cepat, handal dan hemat biaya untuk metode identifikasi bakteri. Tetapi bagaimanapun, memiliki beberapa kekurangan: (i) identifikasi organisme hanya mungkin bila spektral data base berisi informasi tentang gen tertentu seperti 16S rRNA prokariotik, gyrB, rpoB, atau hsp60 strain/spesies dari genus tertentu, (ii) basis data yang harus disiapkan secara lokal untuk taksa tertentu (misalnya, Streptococcus atau Staphylococcus) dimana variasi geografis menyebabkan variasi dalam genotype dan fenotype (Bengali et al., 2011). Selama beberapa tahun terakhir berbagai peneliti telah menunjukkan penerapan MS untuk identifikasi bakteri, taksonomi dan type strain. Haag et al. (1998) menggunakan MALDITOF MS untuk karakterisasi cepat strain patogen Haemophilus. Mereka juga menentukan perbedaan-perbedaan regangan spesifik di antara isolat H. influenzae dari beberapa pasien. Nilsson (1999), mendeteksi regangan spesifik biomarker berdasarkan perbedaan analisis dari enam di strain dari Helicobacter pylori. Lundquist et al. (2005) menunjukkan perbedaan dari empat subspesies F. tularensis menggunakan pendekatan ini. Carbonnelle dkk. (2007) menunjukkan bahwa MALDI- TOF MS adalah alat yang ampuh untuk identifikasi isolat klinis koagulase stafilokokus negatif. MALDI-TOF MS digunakan untuk identifikasi cepat perbedaaan dari sepuluh spesies S. viridans (Friedrichs et al., 2007). Bila diperoleh hasil identifikasi spesies menggunakan MALDI-TOF MS dibandingkan dengan fenotype/genotype sistem identifikasi, kecocokan 100% dicapai. Demikian pula, berbagai Staphylococcus spp., Patogen Neisseria spp., spesies klinis penting ragi dan Mycobacterium spp. yang diidentifikasi menggunakan MALDI-TOF MS (Ilina et al, 2009;. Dubois et al, 2010;.. Stevenson et al, 2010b; Saleeb et al., 2011). Tabel 2 daftar mikroorganisme dalam sel utuh (profil bakteri langsung) digunakan untuk identifikasi bakteri dan type strain.

MALDI-TOF MS tidak hanya digunakan untuk identifikasi spesies namun juga memiliki aplikasi dalam type strain. Kumar et al. (2004) menunjukan bahwa MALDI-TOF MS mungkin menjadi alat yang berguna untuk membedakan strain beta hemolitik streptokokus, dan juga untuk karakterisasi strain untypable kelompok streptokokus A. Eddabra dkk. (2012) menggunakan MALDI-TOF MS untuk membedakan 30 strain lingkungan Vibrio spp. Stephan et al. (2011) menggunakan MALDI-TOF MS untuk identifikasi cepat strain spesies dari Y. Enterocolitica, dan subtyping ke tingkat biotype. Metode MALDI berdasarkan TOF MS telah menjelaskan diskriminasi dan strain mikobakteri, type resisten dan type strain K. pneumonia, yang bertanggung jawab atas wabah nosokomial A. baumannii (Shitikov et al, 2012;. Berrazeg et al, 2013.; Mencacci et al., 2013). Spektrum MALDI-TOF MS pada individu mikroba adalah takson properti - spesifik organisme yang independen dari lokasi geografisnya, kondisi kultur (harus tidak ada perbedaan yang drastis) atau metodologi persiapan sampel. Dengan pendekatan ini, identifikasi tidak hanya bagi anggota spesies isolat baru yang ada tetapi mungkin jika jenis strain mereka sebelumnya telah dipelajari (Ruelle et al., 2004), pengakuan pola fenotipik koheren mungkin juga mencerminkan kembali identitas taksonomi. Kemudahan dan kecepatan dalam identifikasi dari sejumlah besar isolat dapat digunakan untuk mempelajari taksonomi dan keragaman spesifik luar dan dalam (Feli dan Dallaglio, 2007). MALDI-TOF MS pada Virologi Virologi klinis Virus secara tradisional terdeteksi oleh kultur sel, yang meskipun menjadi standar emas, sering embutuhkan waktu beberapa hari atau bahkan minggu sebelum hasil apapun tersedia. Ia kemudian diganti atau dilengkapi dengan metode imunologi dengan tingkat sensitif lebih rendah, berdasarkan analisis antibodi (oleh immunoassay atau immuno fluorescence) dan dengan metode molekuler berdasarkan PCR dan hibridisasi dot blot yang lebih sensitif. Penggunaan MALDI-TOF MS dalam virologi sudah maju seperti yang telah dilakukan pada bakteriologi atau mikologi. Ini mungkin menjadi konsekuensi dari kandungan protein virus yang relatif rendah (Kliem dan Sauer, 2012), bobot molekul protein virus yang lebih tinggi (> 20.000 Da) dan kemungkinan akumulasi larutan dari substrat sel di mana virus yang dikultur secara in vitro. Namun demikian, banyak peneliti telah membuktikan kegunaan MALDI-TOF MS untuk diagnosis berbagai virus menular dalam sampel klinis seperti dalam virus influenza, enterovirus, papillomaviruses manusia (HPV), virus herpes, hepatitis virus dll (Sjöholm et al, 2008;. Yi . et al, 2011; Piao et al, 2012). Menariknya di sebagian besar penelitian, analisa materi genetik virus itu dianalisis oleh PCR dan diperkuat dengan identifikasi oleh MALDI. Sjöholm dkk. (2008) mengembangkan metode skrining efisien berdasarkan MALDI-TOF MS untuk deteksi multipleks dari semua virus herpes manusia yang hadir dalam sampel biologis dibandingkan dengan data arsip. Sensitivitas dan batas deteksi virus dengan metode MALDI-TOF MS tinggi dan sebanding

dengan metode referensi seperti microarray oligonukleotida dan PCR multipleks (Sjöholm et al.,2008). Yi et al. (2011) melaporkan penggunaan metode berbasis PCR MS untuk mendeteksi HPV berisiko tinggi, penyebab utama dari kanker serviks pada manusia. Mereka mengklaim bahwa bahan proses tinggi dan efektifitas biaya terkait dengan metode yang membuatnya cocok untuk diagnosis dalam pengaturan klinis rutin dan untuk studi epidemiologi. Piao et al. (2012) menggabungkan PCR multipleks dengan MALDI-TOF MS dan mengembangkan uji PCR-Massa yang bersamaan mendeteksi delapan virus yang berbeda terkait dengan infeksi enterik pada manusia. Kemudian, Peng et al. (2013) membuktikan utilitas multiplexing MALDITOF untuk mendeteksi jenis-spesifik enterovirus manusia yang berhubungan dengan penyakit tangan, kaki dan mulut. Baru-baru ini, Calderaro dkk. (2014) menyatakan bahwa MALDI- TOF MS adalah alat yang efektif, cepat dan murah untuk mengidentifikasi berbagai serotype virus polio dari perbedaan sampel klinis. Lebih lanjut mereka melaporkan bahwa MALDI-TOF MS, melalui biomarker spesifik virus dapat membantu mendeteksi dan membedakan antara sel yang terinfeksi virus dan sel-sel yang sehat. Viral genotype, Subtyping, dan Studi epidemiologi Terlepas dari identifikasi virus, MALDI-TOF MS juga telah digunakan dalam virologi untuk genotip dari JC polyomaviruses (Bayliss et al, 2010.), Hepatitis B dan virus hepatitis C (Ilina et al, 2005;..Ganova-Raeva et al, 2010) dan untuk mendeteksi mutasi pada virus hepatitis B (Luan et al., 2009). Selain itu, banyak peneliti telah menunjukkan penerapan MALDI-TOF MS untuk penyaringan pada subtype virus influenza dan untuk melacak epidemiologi pada virus influenza (Schwahn et al, 2009, 2010;.Fernandes dan Downard, 2014). Strain baru dari virus influenza sering berasal dari mencampur berbagai bahan genetik dengan beberapa strain umum. Dengan demikian, perkembangan deteksi pada virus influenza merupakan tantangan bagi metode PCR berdasarkan molekuler, karena kegagalan untuk menguatkan mereka ke urutan target primer masing-masing dan perlu dirancang ulang berulang kali. Demikian pula, tes imunologi berbasis antibodi gagal untuk mengidentifikasi antigen reassorted strain virus yang berbeda. Identifikasi dan karakterisasi cepat strain virus influenza diperlukan untuk terapi awal, dan efektif untuk mencegah kemungkinan pandemi. MALDI-TOF MS telah muncul sebagai pendekatan yang sangat berkembang serta cepat dan dapat diandalkan untuk subtype dan jenis virus influenza. Chou et al. (2011) melaporkan penggunaan MALDI-TOF MS dalam kombinasi dengan nanopartikel antibodi-magnetik untuk deteksi dan skrining cepat pada subtype virus influenza. Kemudian, Downard (2013) menjelaskan metode untuk mendeteksi strain dari virus influenza dengan menggunakan seluruh protein virus. Pendekatan proteotyping, subtyping dan type, berhasil menelusuri silsilah virus influenza pada manusia. Dia bahkan menggambarkan keberhasilan pendekatan proteotyping pada karakterisasi strain virus parain influenza, sebagai agen infeksi pernapasan. Deteksi Antiviral Perlawanan Studi mengeni hal ini adalah langka. Namun, MALDI-TOF MS telah membuktikan keampuhan dalam mendeteksi resistensi obat untuk gansiklovir pada cytomegaloviruses yang sering menginfeksi penerima transplantasi (Zürcher et al., 2012). MALDI-TOF MS pada Mikologi Mikologi klinis Metode konvensional untuk identifikasi jamur didasarkan pada sifat morfologi, biokimia, dan imunologi mungkin membutuhkan rentang waktu 2-5 hari, atau lebih, dan sering membutuhkan penggabungan beberapa metode fenotipik untuk interpretasi konklusif. Metode molekuler berdasarkan analisis internal dan gen penyandi 18S rRNA ditulis spacer wilayah 1 dan atau 2 (ITS 1/2) yang membosankan dan memakan banyak waktu (Sendid et al., 2013). identifikasi cepat dan akurat spesies jamur diperlukan untuk inisiasi awal terapi anti jamur. Identifikasi jamur oleh MALDI-TOF MS dalam laboratorium medis mikologi telah bergerak pada kecepatan yang lebih lambat untuk identifikasi bakteri, Karena kompleksitas biologis mereka yang membuat sulit untuk mempelajari mereka secara keseluruhan, dan juga karena keberadaan perbedaan fenotipe jamur (hyphae dan/atau conidia) dalam organisme yang sama (Santos et al., 2010). Untuk mendapatkan hasil PMF , maka direproduksi parameter seperti media kultur, kuantitas / jenis bahan koloni dan waktu inkubasi, sesuai standar prosedur. Juga,

sel-sel jamur mungkin memerlukan pengobatan tambahan dengan asam format, atau asetonitril bersama aliran darah untuk mengganggu dinding sel yang kuat. Studi pertama yang menjelaskan penggunaan MALDI-TOF MS untuk identifikasi dan karakterisasi jamur bersel tunggal, Saccharomyces cerevisiae dilaporkan oleh Amiri-Eliasi dan

Fenselau (2001). Di antara jamur, spektrum PMF telah direproduksi dan dilaporkan untuk ascomycetous dan basidiomycetous ragi termasuk organisme seperti Candida, Cryptococcus, dan Pichia. Genus ragi dari kelompok koloni di dalam plate agar yang dapat secara efisien segaris dengan standar prosedur (seperti yang digunakan dalam bakteri) untuk persiapan sampel MALDI-TOF (Bader, 2013). Namun, Cassagne dkk. (2014) melaporkan bahwa berbagai prosedur MALDI-TOF MS dievaluasi untuk pretreatment identifikasi ragi dan meskipun banyak menyerap tenaga kerja, identifikasi hasil ekstraksi intensif lengkap dengan asam/hasil asetonitril format menghasilkan yang lebih baik. Berbagai peneliti telah melaporkan MALDI-TOF MS adalah pendekatan yang handal dan hemat waktu untuk identifikasi dari berbagai jenis ragi dalam Infeksi aliran darah (Spanu et al, 2012;. Yaman et al, 2012;.. Lavergne et al, 2013). Beberapa peneliti telah menjelaskan penggunaan MALDI-TOF MS untuk mendeteksi berbagai patogen jamur manusia (dalam Tabel 3). Deteksi Resistensi antibiotik di Fungi Identifikasi /prediksi untuk anti jamur oleh MALDI- TOF MS belum maju sebanyak seperti dalam memprediksi resistensi pada bakteri. Ini mungkin disebabkan fakta bahwa resistensi antimycotic pada jamur tidak sesering pada bakteri karena tidak adanya obat untuk menurunkan enzim. Hanya beberapa spesies jamur seperti C.glabrata atau C.krusei dan C.parapsilosis telah dilaporkan masing-masing secara intrinsik resisten terhadap azoles dan echinocandins (Bader, 2013). Demikian pula, resistensi spesies spesifik untuk agen antimycotic diamati pada jamur dan zygomycetes (Pfaller et al, 2002;.. Alastruey-Izquierdo et al, 2010). Dengan demikian, resistensi obat pada isolat jamur dapat diprediksi hanya dengan identifikasi pada spesies jamur oleh MALDI-TOF MS (Bader,2013). Jamur Type Strain dan Taksonomi Penggunaan MALDI-TOF MS untuk type strain dari isolat jamur masih dalam masa percobaan dan tidak sesukses pada bakteri. Berbeda dengan ragi type jamur lebih sulit karena mereka memiliki hubungan filogenetik rumit (Samson dan Varga, 2009) dan morfologi lebih rumit. Bagaimanapun, metode MALDI-TOF MS, dilaporkan layak untuk jenis type strain dengan C. albicans dan C. parapsilosis (Qian et al, 2008;. Pulcrano et al,.2012). Perspektif masa depan Meskipun upaya MS berdasarkan identifikasi bakteri dan diagnosis mikrobiologi dari pertengahan 1970-an hingga dalam beberapa tahun terakhir, tetapi telah disadari potensi dan penerapan MALDI-TOF MS di laboratorium mikrobiologi. Standar emas 16S rRNA-18S rRNA saat identifikasi mikroba dan sequencing gen tidak menguntungkan dari segi biaya dan waktu. Bizzini dkk. (2011) menyatakan bahwa termasuk biaya bahan habis pakai, gaji, dan depresiasi aparat, identifikasi dari isolat bakteri tunggal dengan 16S rRNA sequencing jika dihitung

biayanya sekitar 100 dolar AS di laboratorium mereka dan hasil tersedia setelah 48 jam. Di sisi lain identifikasi dari isolat bakteri tunggal dengan MALDI-TOF MS dapat dilakukan dalam hitungan menit dan jika dihitung biayanya hanya beberapa dolar AS (Seng et al, 2009;.. Cherkaoui et al, 2010). Perbandingan isolat PMF diketahui untuk referensi fingerprinting massa yang ada dalam database adalah langkah paling penting untuk identifikasi spesies yang membutuhkan database yang berisi tidak hanya referensi fingerprinting massa dari semua spesies, tetapi juga fingerprinting massa beberapa strain masing-masing spesies (Lartigue et al., 2009). Teknologi MALDI-TOF MS gagal untuk membedakan E. coli dan Shigella spp. (Bizzini et al., 2010) atau membedakan antara spesies kompleks S.mitis dari Streptococcus (Seng et al, 2009;. Van Veen et al, 2010.). Kegagalan sebelumnya telah dijelaskan oleh fakta bahwa E. coli dan Shigella adalah salah satu spesies filogenetis namun karena kendala sejarah dan klinis mikrobiologi telah dikelompokkan menjadi dua spesies. Alasan untuk deliniasi yang tidak tepat dari S. pneumoniae dan S. mitis adalah hubungan erat antara dua spesies (kendala mikrobiologi) yang tidak dapat dibedakan oleh update database, kecuali tes seperti sensitivitas optochin atau kelarutan empedu (Kilian et al., 2008 ). Kendala MALDI-TOF MS seperti itu tentu perlu ditangani di masa depan. Kendala utama tidak menggunakan MALDI-TOF MS untuk diagnosis mikrobiologis rutin adalah reproduksibilitas PMFs dari spesies mikroba yang sama selama percobaan di laboratorium yang sama atau selama percobaan pada laboratorium yang menggunakan peralatan yang sama/MALDI- TOF. Studi reproduktifitas intra-laboratorium telah menunjukkan konkordansi tingkat yang lebih tinggi pada PMFs selama pengulangan percobaan dengan peralatan MS yang sama menggunakan teknik persiapan sampel sejenis (Walker et al., 2002). Studi lain melaporkan bahwa reproduktifitas intra-laboratorium PMFs tergantung hanya pada kualitas sampel mikroba dan teknik independen persiapan sampel (Croxatto et al., 2012). Namun, mempelajari tentang reproduksibilitas PMFs antar laboratorium penelitian telah menghasilkan hasil yang saling bertentangan. Dua studi penelitian independen menunjukkan tingkat reproduktifitas mikroorganisme identik PMFs yang lebih tinggi, diidentifikasi di laboratorium terpisah menggunakan persiapan sampel dengan teknik yang sama, peralatan MS yang sama dan perangkat lunak analisis yang sama (Wang et al, 1998;.. Walker et al, 2002). Di sisi lain, studi antar laboratorium lain melaporkan konkordansi rendah selama analisis MALDITOF dari aliquot identik E. Coli oleh tiga laboratorium terpisah menggunakan teknik persiapan sampel yang sama, tapi terdapat perbedaan peralatan MALDI-TOF komersial (Wunschel et al., 2005). Kelompok riset ini lebih lanjut menggabungkan spektrum PMF pada laboratorium individu dan membentuk beberapa master laboratorium PMF. Pada beberapa laboratorium master spektrum PMF digunakan untuk mengidentifikasi E. coli, identifikasi diamati 100 persen pada setiap laboratorium (Wunschel et al., 2005). Dengan demikian, studi ini memberikan solusi yang sangat penting untuk pertanyaan mengenai potensi MALDI-TOF MS untuk perbedaan identifikasi mikroba, perbedaan lokasi geografis dan dengan perbedaan peralatan MALDI-TOF. Dengan menggunakan protokol standar untuk analisis MALDI-TOF MS dan menciptakan sebuah perpustakaan/database yang berisi PMFs dari beberapa laboratorium (dengan perbedaan peralatan MALDI-TOF), kendala ini bisa diatasi dengan mudah. Dalam beberapa tahun terakhir telah muncul sejumlah informasi besar tentang MALDITOF MS dan aplikasinya untuk spektrum yang luas terhadap mikroba mulai dari bakteri gram positif dan gram negatif, dari sampel klinis untuk halophiles ekstrim dan dari organisme BSL-3 untuk isolat lingkungan. Alam Luar dunia mikroba, studi terbaru menunjukkan bahwa MALDITOF MS bahkan dapat diterapkan untuk mengidentifikasi alga (von Bergen et al., 2009), nyamuk (Yssouf et al., 2014), nematoda (Perera . et al, 2005), dan serangga (Feltens et al, 2010;. Hoppenheit et al., 2013). Kebebasan kondisi kultur, formulasi kultur, waktu kultur, jumlah inokulum yang dibutuhkan untuk identifikasi, telah membuat MALDI-TOF MS sebagai teknik pilihan di laboratorium mikrobiologi. Ketentuan untuk mengintegrasikan database yang dibangun dalam database publik MALDI-TOF MS, serta pengembangan software denga biaya murah serta dengan penggunaan yang mudah untuk perbandingan dan analisis akan lebih meningkatkan kredibilitas MALDI-TOF MS di masa depan. Apa yang tampak berlebihan kadang-kadang kini telah kembali menjadi realitas. MALDI-TOF MS telah menjadi alat yang berharga untuk laboratorium mikrobiologi, yang berpotensi menggantikan teknik identifikasi molekuler dalam waktu dekat.