Isolasi Dna.ppt 4c14l

ISOLASI DNA Dian Riana Ningsih

DNA Merupakan molekul yang amat panjang terdiri dari ribuan deoksiribonukleotida yang bergabung dalam suatu urutan yang bersifat khas bagi tiap organisme Sel prokariot Mengandung kromosom yang merupakan satu molekul DNA yang berkaitan erat menjadi daerah inti atau nukleoid Selain itu ditentukan DNA berukuran kecil berbentuk lingkaran yang disebut dengan plasmid Gambar. Unsur genetik bebas yang terdapat di dl sel bakteri

plasmid Kromosom bakteri

Sel eukariot • Mengandung lebih banyak DNA • DNA berukuran jauh lebih besar • DNA bergabung dengan protein menjadi serabut kromatin di dalam nukleus (histon) yang dikelilingi oleh sistem membran ganda yang bersifat kompleks • Masing-masing kromosom membawa serangkaian gen yang bersifat unik Gen : bagian dari kromosom yang menunjukkan spesifitas suatu sifat tertentu Jumlah kromosom normal pada berbagai spesies - Organisme prokariot - Bakteri

-

1

Organisme eukariot -

Kucing Mencit Tikus Kelinci Manusia Ayam

38 38 40 44 46 78

Pemurnian DNA dari Sel Hidup Tiga macam DNA yang diperlukan oleh ahli rekayasa 1. DNA sel total Sebagai sumber bahan untuk memperoleh gen yang akan diklon Dapat berasal dari kultur sel bakteri, sel tanaman, sel hewan 2. DNA plasmid yang murni Langkah-langkah dasar preparasi DNA plasmid sama dengan pemurnian DNA sel total  perbedaan : DNA plasmid harus dipisahkan dari DNA kromosom yang juga terdapat bersama dalam sel 3. DNA fag Diperlukan jika vektor fag digunakan untuk kloning

Preparasi DNA Sel Total Prosedur preparasi DNA totel dari kultur sel bakteri : 1. Kultur bakteri ditumbuhkan kemudian dipanen 2. Sel dilisis untuk mendapat ekstrak kasar 3. DNA dimurnikan dari ekstrak kasar 4. Larutan DNA yang dihasilkan kemudian dipekatkan

Preparasi DNA Sel Total

Menumbuhkan dan menanam kultur bakteri Medium untuk kultur harus memberikan campuran nutrien penting yg seimbang pd konsentrasi yang memungkinkan bakteri tumbuh dan membelah secara efisien Tabel: komposisi dua media khas untuk pertumbuhan kultur bakteri Komponen g/l 1. medium M9  Na2HPO4 6,0  KH2PO4 3,0  NH4Cl 1,0  NaCl 0,5  MgSO4 0,5  Glukosa 2,0

2. medium LB (Luria-Bertani)   

Tripton Yeast ekstrak NaCl

10 g/l 5 g/l 10 g/l

 Medium M9  medium tertentu (defined medium) 

semua komponennya diketahui  Medium LB  medium kompleks (undefined) identitas dan kuantitas komponen2 nya yang tepat tidak diketahui Tripton dan ekstrak ragi  campuran senyawa kimia yang tidak diketahui Tripton  asam amino dan peptida Ekstrak ragi  nitrogen, gula serta nutrien organik dan anorganik

Dalam medium LB pada 37 C dengan pengocokan pada kecepatan 150-250 rpm/ menit, sel E. coli akan membelah sekali setiap 20 menit sampai kultur mencapai densitas maksimum kira-kira 2-3 x 109 sel/ml. Pertumbuhan kultur dapat dimonitor dengan cara pembacaan densitas optik pada panjang gelombang 600 nm Untuk E. coli 1 unit OD = 0,8 x 109 sel/ml sentrifuge Endapan sel

Preparasi Ekstrak Sel Sel bakteri terbungkus dalam membran sitoplasma dan dikelilingi oleh dinding sel yang kuat Teknik-teknik untuk memecah dan membuka isi sel bakteri : 1. cara fisik Sel dipecah dengan kekuatan mekanis 2. cara kimiawi Dilakukan dengan senyawa yang merusak dinding sel dan senyawa lain yang merusak membran sel Lisozim  mendigesti senyawa polimetrik yang menyebabkan kekakuan dinding EDTA  menghilangkan ion Mg yang penting untuk mempertahankan keseluruhan struktur selubung sel, disamping dapat menghambat enzim-enzim selular yang dapat merusak DNA Detergen  untuk mengganggu interaksi ionik antara histon yang bermuatan positif dan tulang punggung DNA yangg bermuatan negatif. Untuk menjamin pemecahan kompleks DNA-protein

A. Lisis sel

Merusak dinding sel

Merusak membran sel

Ekstrak sel

B. Sentrifugasi untuk menghilangkan debris sel

DNA, RNA, protein Debris sel

Sentrifugasi 8000 rpm, 10 menit

Pemurnian DNA dari ekstrak sel Cara baku untuk menghilangkan protein dari ekstrak sel adalah dengan penambahan fenol atau campuran fenol dan kloroform (1:1)  presipitasi protein tetapi DNA & RNA tetap berada dalam larutan

+ fenol

sentrifuge

Lapisan air (DNA +RNA) Koagulasi protein Fenol

Ekstrak sel Proteinase K : memecah polipeptida menjadi unit yang lebih kecil  lebih mudah dihilangkan

RNA  dihilangkan dg menambahkan enzim nuklease  sub unit ribonukleotida

Pemekatan sampel DNA A.

Etanol absolut ditambahkan pada lapisan atas larutan DNA yang pekat. Serabut-serabut DNA dapat ditarik dengan batang kaca

etanol Serabut DNA

Larutan DNA pekat

B Untuk larutan DNA encer, maka presipitat diperoleh dengan sentrifugasi. (untuk 1 volume larutan DNA + 2,5 volume etanol absolut). presipitat dilarutkan dengan H2O steril

etanol

Inkubasi semalaman suhu -15 oC atau 15 menit suhu -70 oC.

Presipitat DNA dihasilkan dg sentrifugasi

Pengukuran DNA Spektrofotometri UV  Banyaknya radiasi UV yang diserap oleh larutan DNA ~ DNA dalam sampel  λ = 260 nm  nilai nilai 1 = 50 g DNA untai ganda / ml  Kemurnian : A 260 = 1,8 A 280

Sel bakteri 1. suspensi dalam EDTA 2. + lisozim, inkubasi 3. + 25 % SDS, panaskan 4. + NaCl 5. + CHCl3 – penol 6. sentrifugasi pada 10.000 g Lapisan organik (bawah)

lapisan air (atas)

protein pada antar permukaan

+ etanol 95 % Lapisan air

DNA pada endapan karakterisasipeartial dengan spektro UV

Diagram alir isolasi DNA dari sel bakteri