Iso 7218_definiçoes Gerais.pdf 5j292k

Padrão Internacional

ISO 7218 Terceira edição 15/08/2007

Microbiologia de alimentos e de produtos de alimentação animal – Exigências gerais e orientações para análises microbiológicas –

PADRÃO INTERNACIONAL

ISO 7218:2007

ii

PADRÃO INTERNACIONAL Sumário

ISO 7218:2007 Página

Prefácio ................................................................................................................................................................... v Introdução ............................................................................................................................................................. vi 1. Âmbito de aplicação ....................................................................................................................................... 1 2. Referências normativas .................................................................................................................................. 1 3. Premissas ........................................................................................................................................................ 2 3.1. Geral ......................................................................................................................................................... 2 3.2. Considerações de segurança ................................................................................................................ 2 3.3. Projeto de laboratório ............................................................................................................................. 2 3.4. Áreas laboratoriais .................................................................................................................................. 3 3.5. Disposição e estruturação do local ....................................................................................................... 4 3.6. Limpeza e desinfecção ........................................................................................................................... 5 4. Quadro de funcionários .................................................................................................................................. 5 4.1. Geral ......................................................................................................................................................... 5 4.2. Competências .......................................................................................................................................... 6 4.3. Verificação de competência em curso de funcionários ...................................................................... 6 4.4. Higiene...................................................................................................................................................... 6 5. Utensílios e equipamentos............................................................................................................................. 6 5.1. Geral ...................................................................................................................................................... 6 5.2. Câmaras de proteção .......................................................................................................................... 7 5.3. Balanças e diluidores gravimétricos ................................................................................................. 8 5.4. Homogeneizadores, liquidificadores e misturadores ...................................................................... 9 5.5. pHmetro .............................................................................................................................................. 10 5.6. Autoclave ............................................................................................................................................ 11 5.7. Preparador de meio ........................................................................................................................... 12 5.8. Estufa/incubadora ............................................................................................................................. 12 5.9. Refrigeradores, salas refrigeradas .................................................................................................. 13 5.10. Congeladores e ultracongeladores ................................................................................................. 14 5.11. Banho-maria controlado via termostato ......................................................................................... 15 5.12. Aquecedores a vapor, incluindo banhos-maria de fervura ........................................................... 16 5.13. Forno de esterilização ....................................................................................................................... 17 5.14. Forno de microondas ........................................................................................................................ 17 5.15. Lavadora de vidrarias........................................................................................................................ 18 5.16. Microscópio óptico ............................................................................................................................ 19 5.17. Bico de Bunsen e queimadores ....................................................................................................... 19 5.18. Dispensadores para meios de cultura e reagentes ....................................................................... 20 5.19. Misturador do tipo vórtice ................................................................................................................ 20 5.20. Dispositivo de contagem de colônias ............................................................................................. 21 5.21. Equipamento para cultivo em atmosfera alterada ......................................................................... 22 5.22. Centrífuga ........................................................................................................................................... 22 5.23. Manta e chapa de aquecimento ....................................................................................................... 23 5.24. Semeador helicoidal .......................................................................................................................... 23 5.25. Destiladores, deionizadores e unidades de osmose-reversa ....................................................... 24 5.26. Cronômetros e dispositivos temporizadores ................................................................................. 24 5.27. Pipetas e pipetadores........................................................................................................................ 25 5.28. Termômetros e dispositivos de monitoramento de temperatura, incluindo registradores automáticos ........................................................................................................................................... 26 5.29. Separador imunomagnético ............................................................................................................. 27 5.30. Sistema de filtração ........................................................................................................................... 27 5.31. Outros equipamentos e programas ................................................................................................. 28

iii


ISO 7218:2007

6. Preparação de vidrarias e outros materiais de laboratório ...................................................................... 28 6.1. Preparação ............................................................................................................................................. 28 6.2. Esterilização/descontaminação ........................................................................................................... 28 6.3. Equipamentos e materiais descartáveis ............................................................................................. 28 6.4. Armazenamento de vidrarias e materiais limpos .............................................................................. 28 6.5. Manipulação de vidrarias e materiais estéreis ................................................................................... 29 6.6. Uso de descontaminação e desinfecção ............................................................................................ 29 6.7. Manejo de descarte ............................................................................................................................... 29 6.8. Lavagem ................................................................................................................................................. 30 7. Preparação e esterilização de meios de cultura ........................................................................................ 30 8. Amostras laboratoriais ................................................................................................................................. 30 8.1. Amostragem........................................................................................................................................... 30 8.2. Transporte .............................................................................................................................................. 31 8.3. Recepção................................................................................................................................................ 31 8.4. Armazenamento .................................................................................................................................... 32 8.5. Porção teste ........................................................................................................................................... 32 9. Análise ............................................................................................................................................................ 32 9.1. Cuidados de higiene no decorrer da análise ...................................................................................... 32 9.2. Preparação de suspensão inicial e diluições ..................................................................................... 34 10. Enumeração ................................................................................................................................................... 34 10.1. Geral .................................................................................................................................................... 34 10.2. Enumeração usando meio sólido .................................................................................................... 35 10.3. Cálculo e descrição dos resultados obtidos em meio sólido ....................................................... 37 10.4. Enumeração de bolores e leveduras ............................................................................................... 43 10.5. Enumeração usando meio líquido ................................................................................................... 44 11. Método de detecção (método qualitativo) .................................................................................................. 49 11.1. Geral .................................................................................................................................................... 49 11.2. Princípio ............................................................................................................................................. 50 11.3. Medição de incertezas....................................................................................................................... 50 12. Métodos de confirmação .............................................................................................................................. 50 12.1. Geral .................................................................................................................................................... 50 12.2. Preparação de cultura pura .............................................................................................................. 50 12.3. Coloração de Gram (técnica de Hucker modificada) ..................................................................... 50 12.4. Utilização de galerias bioquímicas para identificação .................................................................. 52 12.5. Utilização de sondas nucléicas para identificação ........................................................................ 52 12.6. Métodos sorológicos ......................................................................................................................... 53 13. Relatório de análise ...................................................................................................................................... 53 14. Validação de métodos microbiológicos ..................................................................................................... 54 14.1. Validação de métodos de referência ............................................................................................... 54 14.2. Validação de métodos alternativos ................................................................................................. 54 14.3. Validação de métodos internos ....................................................................................................... 54 15. Certificação de qualidade de resultados/controle de qualidade de desempenho ................................. 54 15.1. Controle interno de qualidade .......................................................................................................... 54 15.2. Linhagens de referência ................................................................................................................... 54 15.3. Avaliação externa de qualidade (teste de proficiência)................................................................. 55 Anexo A (informativo) Propriedades de alguns desinfetantes ......................................................................... 56 Anexo B (normativo) Determinação de número mais provável (NMP) ............................................................ 57 Bibliografia ........................................................................................................................................................... 64

iv


ISO 7218:2007

Prefácio

ISO (Organização Internacional de Normalização) trata-se de uma federação mundial de órgãos nacionais de normalização (órgãos membros da ISO). O trabalho de preparar Normas Internacionais de padronização é normalmente realizado por um comitê técnico da ISO. Cada órgão membro interessado em um assunto para o qual um comitê é estabelecido tem o direto de eleger uma representante neste comitê. Organizações internacionais, governamentais e não governamentais ligadas à ISO, também participam dos trabalhos. ISO colabora estreitamente com a Comissão Eletrotécnica Internacional (IEC) em tudo que diz respeito a normalizações eletrotécnicas. Os Padrões Internacionais são elaborados de acordo com regras estabelecidas nas Diretivas ISO/IEC, Parte 2. A principal tarefa dos comitês técnicos é preparar Padrões Internacionais. Projetos internacionais de normalizações adotados pelos comitês técnicos são submetidos aos órgãos membros para votação. A publicação de um artigo de Normalização Internacional requer a aprovação de ao menos 75% dos órgãos membros votantes. Atentar para a possibilidade de que parte dos elementos constantes neste documento podem ser alvos de direitos de patentes. A ISO não se responsabiliza por identificar quaisquer direitos de patentes. A ISO 7218 foi preparada pelo Comitê Técnico ISO/TC 34, Food products, Subcomitê SC 9, Microbiology em colaboração com o Comitê Técnico CEN/TC 275, Food analysis – Horizontal methods. Esta terceira edição cancela e substitui a segunda edição (ISO 7218:1996), a qual foi tecnicamente revisada. Ela ainda incorpora a Emenda ISO 7218:1996/Emenda 1:2001.

v


ISO 7218:2007(E)

Introdução Quando da realização de análises microbiológicas é especialmente importante que -

Apenas aqueles microrganismos que estão presentes na amostra sejam isolados e enumerados;

-

Os microrganismos não contaminem o ambiente.

Para conseguir isto, é necessário prestar atenção à higiene pessoal e usar técnicas de trabalho que garantam, o tanto quanto possível, exclusão de contaminação exógena. Uma vez que, neste Padrão Internacional, é possível fornecer apenas alguns exemplos de cuidados a serem tomados durante as análises microbiológicas, um conhecimento meticuloso das técnicas microbiológicas aplicadas e dos microrganismos envolvidos é essencial. É importante que as análises sejam conduzidas o mais precisamente possível, incluindo o monitoramento e registro de aspectos que podem influenciar os resultados e cálculos de número de microrganismos e a incerteza dos resultados. Em última análise, é de responsabilidade do chefe de laboratório julgar se as manipulações são seguras e podem ser consideradas como boas práticas laboratoriais. Um grande número de manipulações podem, por exemplo, não intencionalmente levar á contaminação cruzada, e o analista deveria sempre verificar a precisão dos resultados fornecidos pela técnica dele(a). Para conduzir as análises corretamente, é necessário tomar certas precauções quando construindo e equipando um laboratório. Alguns cuidados devem ser tomados, não somente por razões de higiene, mas também para garantir a boa reprodutibilidade dos resultados. Não é possível determinar todos os cuidados a serem tomados em todas as circunstâncias, mas este Padrão Internacional ao menos fornece as principais medidas a serem tomadas quando do preparo, esterilização, armazenamento de meio e uso do equipamento. Se as orientações fornecidas neste Padrão Internacional forem seguidas, isto contribuirá para a manutenção da saúde e segurança pessoal. Informações adicionais a respeito deste tema podem ser encontradas na literatura fornecida na Bibliografia.

vi

Microbiologia de alimentos e de produtos de alimentação animal – Exigências gerais e orientações para análises microbiológicas

1.

Âmbito de aplicação

Este Padrão Internacional apresenta exigências gerais e orientações/opções destinadas a três principais usos: -

Implementação dos padrões ISO/TC 34/SC 9 ou ISO/TC 34/SC5 para detecção ou enumeração de microrganismos, chamados a seguir “padrões específicos”;

-

Boas práticas de laboratório para laboratórios de análises microbiológicas (o objetivo não é tratar disto neste Padrão Internacional, há manuais disponíveis sobre isto);

-

Orientações para credenciamento de laboratórios de análises microbiológicas de alimentos (este Padrão Internacional descreve exigências técnicas de acordo com o Anexo B da ISO/IEC 17025:2005 para credenciamento de laboratórios microbiológicos por órgãos nacionais).

As exigências deste Padrão Internacional substitui às correspondentes por padrões específicos pré-existentes. Instruções adicionais no campo das análises de biologia molecular estão especificadas na ISO 22174. Este Padrão Internacional cobre a análise de bactérias, fungos e leveduras e pode ser utilizado, se suplementado com as orientações específicas, para príons, parasitas e vírus. Ele não cobre a análise de toxinas e outros metabólitos (e.g. aminas) advindos de microrganismos. Este Padrão Internacional aplica-se à microbiologia de alimentos, produtos de alimentação animal, ambientes de produção de alimentos e ambientes de produção primária. O propósito deste Padrão Internacional é ajudar a garantir da validade das análises microbiológicas dos alimentos, ajudar na garantia de que as técnicas gerais utilizadas na condução destas análises são as mesmas em todos os laboratórios, ajudar a alcançar a homogeneidade de resultados entre laboratórios, e contribuir para a segurança dos analistas evitando riscos de contaminação. 2.

Referências normativas

As referências normativas citadas são indispensáveis para a aplicação deste documento. Para referências datadas, apenas a edição citada se aplica. Para referências não datadas a edição mais recente da publicação referenciada se aplica (incluindo quaisquer emendas). ISO 835 (todas as partes), Vidrarias laboratoriais – Pipetas graduadas ISO 6887 (todas as partes), Microbiologia de alimentos e de produtos de alimentação animal – Preparação de amostras-teste, suspensão inicial e diluições decimais para análises microbiológicas. ISO 8199, Qualidade de água – Orientações gerais para a enumeração de microrganismos por meio de cultivo ISO 8261, Leite e produtos derivados – Orientações gerais para a preparação de amostras teste, suspensão inicial e diluições decimais para análise microbiológica. ISO 8655-1, Dispositivos volumétricos operados por pistão – Parte 1: terminologia, exigências gerais e recomendações ao usuário 1

ISO/TS 11133 (Todas as partes) Microbiologia de alimentos e de produtos alimentação animal – Diretrizes para preparação e produção de meio de cultura ISO 16140, Microbiologia de alimentos e produtos de alimentação animal – Protocolo para validação de métodos alternativos ISO/TS 19036, Microbiologia de alimentos e produtos de alimentação animal – Orientações para a estimativa de medição de incertezas para determinações quantitativas ISO 22174, Microbiologia de alimentos e produtos de alimentação animal – Reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção de patógenos transmitidos por alimentos – Exigências gerais e definições 3.

Premissas

3.1.

Geral

Este item apresenta exigências gerais, e.g. os princípios de planejamento e organização, para a disposição de um laboratório microbiológico. Análises de amostras do estágio de produção primária (especialmente de recepção e preparo de amostras) devem ser separadas de análises de outras amostras para reduzir o risco de contaminação cruzada. 3.2.

Considerações de segurança

O projeto de laboratório deve cumprir com exigências de segurança as quais dependerão do tipo de microrganismo. Para este fim, os microrganismos são classificados em quatro categorias de risco: -

Categoria de risco 1 (nenhum ou risco muito baixo individual e para comunidade);

Um microrganismo que é improvável de causar doença em humanos e animais. -

Categoria de risco 2 (risco moderado individual, baixo risco à comunidade).

Um patógeno que pode causar doença em humanos e animais, mas dificilmente apresente perigo biológico sério aos trabalhadores do laboratório, a comunidade ou ao ambiente. Exposições podem causar infecção humana séria, mas tratamentos efetivos e medidas preventivas estão disponíveis e o risco de disseminação da infecção é limitado. -

Categoria de risco 3 (alto risco individual, baixo risco à comunidade)

Um patógeno que geralmente causa doença humana ou animal séria, mas normalmente não disseminada de um individuo para outro. Tratamento efetivo e medidas preventivas estão disponíveis. -

Categoria de risco 4 (alto risco individual e à comunidade)

Um patógeno que geralmente causa doença séria em humano ou animal e que pode ser prontamente transmitida de um indivíduo para outro, direta ou indiretamente. Tratamentos efetivos e medidas preventivas não estão disponíveis. ATENÇÃO – Consultar os regulamentos e leis nacionais os quais definem, em particular, a categoria de risco do microrganismo encontrado no país em questão.

3.3.

Projeto de laboratório

As orientações para as disposições laboratoriais descritas abaixo abrangem a detecção de microrganismos pertencentes às categorias 1, 2 e 3 para microbiologia de alimentos. Deve-se notar que medidas de segurança adicionais podem ser necessárias dependendo da legislação local.

2

3.4.

Áreas do laboratório

3.4.1.

Geral

O laboratório constitui-se de áreas associadas a amostras e análises (ver 3.4.2.) e áreas gerais (ver 3.4.3.). Estas devem ser separadas. 3.4.2.

Áreas associadas com amostras e análises

É considerada boa prática a separação de locais, ou clara designação de áreas, para os seguintes propósitos: -

Recepção e armazenamento de amostras;

-

Preparação de amostras, particularmente no caso de matéria prima (e.g. produtos em pó contendo um alto número de microrganismos);

-

Análises de amostras (de suspensões iniciais), incluindo incubação de microrganismos;

-

Manipulação de patógenos presuntivos;

-

Armazenamento de linhagens de referência e outras;

-

Preparação e esterilização de meios de cultura e equipamentos;

-

Armazenamento de meios de cultura e reagentes;

-

Análises de esterilidade de produtos alimentícios;

-

Descontaminação;

-

Limpeza de vidrarias e outros equipamentos;

-

Armazenamento de produtos químicos perigosos, preferencialmente mantidos em câmaras especialmente desenhadas para isto, armários, salas ou prédios.

3.4.3.

Áreas gerais

Devem ser consideradas áreas separadas para as seguintes finalidades: -

Entradas, corredores, escadas, elevadores;

-

Áreas istrativas (e.g. secretarias, escritórios, salas de documentação, etc.);

-

Vestiários e sanitários;

-

Salas de arquivo;

-

Lojas e conveniências;

-

Salas de descanso.

3

3.5.

Disposição e propriedades do local

3.5.1.

Objetivos

O objetivo é garantir que o ambiente no qual as análises microbiológicas são realizadas, não afete a confiabilidade dos resultados dos testes. Organizar os locais de modo a evitar contaminação cruzada. Maneiras de se evitar isso, são por exemplo: a) Construir um laboratório de acordo com o princípio do sentido único de fluxo; b) Realizar os procedimentos de maneira sequencial tomando os devidos cuidados para garantir a integridade do teste e das amostras (e.g. usar recipientes fechados); c) Separar atividade espacial e temporalmente. Evitar condições extremas como excesso de temperatura, pó, humidade, vapor, barulho, vibração, etc. Os espaços devem ser suficientes para permitir que as áreas de trabalho sejam mantidas limpas e organizadas. O espaço necessário deve se relacionado ao volume de análises desenvolvidas e à organização global interna do laboratório. O espaço deve atender às regulamentações nacionais, quando estas existirem. 3.5.2.

Estruturação

O ambiente de testes deve ser construído e equipado das seguintes maneiras a fim de evitar o risco de contaminação por poeira e por consequência por microrganismos (para microrganismos incluídos na categoria de risco 3, consultar as disposições regulamentais nacionais). a)

As paredes, teto e piso devem ser lisos, fáceis de limpar e resistentes a detergentes e desinfetantes usados em laboratórios.

b)

Pisos devem ser antiderrapantes.

c)

A tubulação de agem de líquidos não deve ar sobre os locais a menos que estejam hermeticamente fechados. Quaisquer outras estruturas que em pelo teto tem que estar cobertas ou ser de fácil o para limpeza.

d)

Janelas e portas devem ser fecháveis para minimizar a corrente de ar durante a realização das análises. Além disso, elas devem ser projetadas para evitar o acúmulo de poeira e ser de fácil limpeza. A temperatura ambiente (18ºC a 27ºC) e a qualidade do ar (composição microbiana, taxa de espalhamento de poeira, etc.) devem ser compatíveis com a realização de análises. Um sistema de ventilação com filtragem do ar que entra e sai é recomendado para esta aplicação.

e)

Um sistema de extração adequado deve ser instalado para evitar a dispersão no ar de pós de meio de cultura desidratado e de amostras.

f)

Quando os testes estão sendo conduzidos em uma atmosfera de baixa contaminação, a sala deve ser especialmente equipada com uma cabine de fluxo laminar ou cabine de segurança.

g)

Caso necessário, o ambiente laboratorial pode ser protegido da radiação do sol usando-se persianas ou vidro especialmente tratado. Não é recomendável a utilização de persianas internamente, uma vez que elas podem dificultar a limpeza e se tornar uma fonte de poeira.

3.5.3.

Outros pontos

Os seguintes pontos devem ser considerados: -

A disponibilidade de suprimento de água, de qualidade adequada para o uso desejado; 4

-

Disponibilidade de eletricidade;

-

Disponibilidade de gás (encanado ou engarrafado);

-

Iluminação adequada em todas as seções do laboratório;

-

Bancadas e mobiliário lisos, impermeáveis e de fácil limpeza e desinfecção;

-

Mobiliário para laboratório que permita a fácil limpeza dos pisos (e.g. mobília móvel);

-

Nenhum móvel, documento ou outro item que não seja estritamente necessário para as atividades de análise devem ser mantidos nas áreas de análise;

-

Disponibilidade de armários para manter os documentos usados quando da manipulação de amostras, meios de cultura, reagentes, etc.;

-

Disponibilidade de pias para lavagem das mãos em cada sala de análise e, se necessário, em áreas gerais, preferencialmente perto das portas;

-

Disponibilidade de uma autoclave para destruição de material de descarte e meios de cultura contaminados, a menos que haja um sistema apropriado de remoção de descarte contaminado para incineração;

-

Disponibilidade de um sistema de segurança que cubra incêndios, emergências elétricas e chuveiro de emergência e lava-olhos;

-

Disponibilidade de instalações de primeiros socorros.

3.6.

Limpeza e desinfecção

Os seguintes pontos devem ser checados. a)

Os pisos, paredes, tetos, bancadas do laboratório, mobília e junções entre estes devem ser submetidos à manutenção e reparo regulares para evitar rachaduras que podem atuar como fonte de contaminação.

b)

Limpeza e desinfecção frequente devem ser realizadas para manter os locais em condições adequadas para a condução dos testes. Superfícies contaminadas ou potencialmente contaminadas devem ser descontaminadas usando desinfetantes de atividade bactericida e fungicida conhecida. NOTA 1: Salas e equipamentos podem ser descontaminados por fumegação de vapor de formaldeído, se permitido pelas disposições de regulamentação nacional.

c)

O sistema de ventilação e seus filtros devem ser regularmente submetidos à manutenção e os filtro trocados sempre que necessário.

d)

A qualidade microbiológica das superfícies de trabalho do laboratório, superfícies de contato com a equipe de analistas, e o ar devem ser monitorados regularmente (a frequência depende dos resultados de testes anteriores).

e)

A contaminação de superfícies pode ser estimada pela aplicação direta de uma placa contendo neutralizadores de agentes sanitizantes (e.g. lecitina, tiossulfato de sódio). A qualidade do ar pode ser analisada pela exposição por 15 min de uma placa de Petri aberta contendo meio ágar não seletivo (e.g. placa de ágar de contagem – PAC) ou um ágar seletivo apropriado para os microrganismos alvo da análise (e.g. bolores). NOTA 2: Outros métodos podem também ser utilizados para estimar a contaminação de superfícies e do ar. Ver ISO 18593.

4.

Quadro de funcionários

4.1.

Geral

Exigências gerais de competências do quadro de funcionários podem ser encontradas na ISO/IEC 17025. 5

4.2.

Competências

Para cada método ou técnica, critérios objetivos devem ser definidos para a determinação da competência apropriada, ambos inicialmente e durante o processo. As competências podem ser estabelecidas no laboratório por controles internos de qualidade (ver 15.1.2.). NOTA: Uma das maneiras de averiguar desempenho baixo (pipetagem, pouco homogeneização de suspensões iniciais, contagem, etc.) no caso de enumerações por contagem de colônias é apresentada na ISO 14461-1.

4.3.

Verificação de competências em curso de funcionários

A verificação de competências em curso de funcionários pode ser avaliada regularmente usando parâmetros objetivos. Isto inclui a participação em programas internos de certificação de qualidade, testes de proficiência (ver ISO/IEC Manual 43-1), o uso de materiais de referência ou por teste auto-verificação para enumeração de microrganismos como descrito na ISO 14461-2. 4.4.

Higiene

Os seguintes cuidados de higiene pessoal devem ser tomados para evitar a contaminação de amostras e meios de cultura e evitar o risco de infecção dos funcionários. a)

Usar vestimentas apropriadas ao laboratório, não apertadas, limpas e em boas condições, não inflamáveis. Esta roupa não deve ser utilizada fora das áreas de trabalho do laboratório e, possivelmente, vestiários.

b)

Usar protetores para cabelo e barba, se necessário para a integridade das amostras.

c)

Manter unhas limpas e preferencialmente curtas.

d)

Lavar as mãos vigorosamente em água morna, preferencialmente em pias de abertura não manual, antes e depois das análises microbiológicas e imediatamente após ir ao sanitário. Usar sabão líquido ou em pó, ou se possível sanitizador, aplicado por dispensador mantido limpo. Para a secagem das mãos, usar papéis ou toalhas descartáveis. Estas medidas são aplicáveis ao corpo de funcionário e também aos visitantes do laboratório.

e)

Quando trabalhando com amostras expostas, culturas, meios, e quando da inoculação, evitar falar, tossir, etc.

f)

Pessoas com infecções de pele ou doenças devem tomar cuidados de modo que os microrganismos destas patologias não contaminem as amostras e podem invalidar os resulatdos.

g)

Não comer ou beber no laboratório e não colocar alimentos de consumo pessoal nos refrigeradores ou congeladores.

h)

Pipetagem com a boca é terminantemente proibido.

5.

Utensílios e equipamentos

5.1.

Geral

De acordo com as boas práticas de laboratório, todos os utensílios e equipamentos devem ser mantidos limpos e em boas condições de funcionamento. Antes do uso, o equipamento deve ser verificado quanto a sua aplicabilidade a função em questão e seu desempenho monitorado durante o uso, quando apropriado. Quando necessário, equipamentos e dispositivos de monitoramento devem ser calibrados de acordo com padrões nacionais vigentes, e a recalibração, quaisquer checagens intermediárias realizadas, procedimento e resultados devem ser documentados; 6

Os equipamentos devem ser averiguados e submetidos à manutenção frequentemente para garantir a segurança e adaptabilidade ao uso. Os equipamentos devem ser monitorados de acordo com as condições de trabalho e acurácia necessário para os resultados. A frequência de calibração e verificação de cada item do equipamento não está, na maioria dos casos, especificada neste Padrão Internacional, uma vez que isto deve ser determinado por cada laboratório, dependendo do tipo de equipamento e do nível de atividade do laboratório, e de acordo com as instruções do fabricante. Em um pequeno número de casos, uma frequência foi estipulada quando considerado essencial. Utensílios e aparelhos devem ser construídos e instalados de modo a facilitar a operação e permitir a fácil manutenção, limpeza, descontaminação e calibração. Quaisquer incertezas de medição indicadas neste item referem-se aos aparelhos e equipamentos em questão e não ao método de análise. Neste item são apresentadas exigências de acurácia de medição de equipamentos de medida. Estes são baseados na tolerância prática necessária para apresentar controles confiáveis dos equipamentos no uso de rotina. A acurácia estabelecida é relacionada à incerteza metrológica do dispositivo (ver ISO guia 99). Para equipamento de controle de temperatura, averiguar a estabilidade e homogeneidade da temperatura antes do uso inicial e após quaisquer reparos ou modificações que possam surtir efeito no controle de temperatura. 5.2.

Cabines de proteção

5.2.1.

Descrição

Uma cabine de proteção é um posto de trabalho com fluxo laminar horizontal ou vertical de ar com a finalidade de remover poeiras e outras partículas, como microrganismos, do ar. O maior número tolerável de partículas por metro cúbico com um tamanho maior ou igual a 0,5 µm representa a classe de partículas difundíveis de uma cabine de segurança. Para cabines utilizadas em análises microbiológicas de alimentos, o número de partículas não deve exceder 4.000 por metro cúbico. Cabines para uso em laboratórios de microbiologia de alimentos são de quatro tipos. a) Cabines de segurança classe I são abertas frontalmente, exigem proteção via exaustão e são destinadas a proteger o operador e o ambiente mas não protegem o produto de contaminação exógena. Aerossóis potencialmente infectados ficarão retidos nas cabines e nos filtros. O ar filtrado normalmente é ejetado para a atmosfera; se isso não for feito, o ar deve ar através de filtros 2 HEPA montados em série. Elas não são recomendadas para trabalhos com microrganismos da com patógenos da categoria 3 por causa da dificuldade em se manter e assegurar a proteção apropriada do operador. b) Cabines de segurança classe II protegem o produto, o operador e o ambiente. Elas recirculam um pouco do ar filtrado, expelindo uma parte para a atmosfera e repondo-o com ar da atmosfera pela abertura de trabalho, fornecendo proteção ao operador. Elas são adequadas para trabalhos com patógenos da categoria 3. c) Cabines de fluxo laminar horizontal protegem o trabalho de contaminação, mas sopram no rosto do operador quaisquer aerossóis gerados. Elas não são adequadas para manipulação de culturas inoculadas ou preparações de culturas de tecidos. d) Cabines de fluxo laminar verticais protegem o produto por meio de fluxo laminar de ar filtrado por filtros HEPA. Elas também protegem o operador por usar ar recirculado internamente. Elas são particularmente adequadas por fornecer um ambiente asséptico para a manipulação de produtos estéreis e por proteger o operador quando manipulando pós. Usar cabines de proteção para todo trabalho envolvendo a manipulação de patógenos e produtos contaminados, caso seja exigido por disposições regulamentais nacionais.

7

O uso de bicos de Bunsen ou queimadores de alças não é recomendado nas cabines de proteção. Caso o uso seja necessário, o bico de Bunsen deve ter uma chama pequena de modo que o fluxo de ar não seja perturbado. O uso de equipamentos descartáveis (alças, pipetas, etc.) é uma alternativa adequada. 5.2.2.

Uso

As cabines devem ser mantidas sem equipamentos na medida do possível. Quando praticável, colocar tudo que for necessário dentro da cabine antes de iniciar o trabalho para minimizar o número de movimentos do braço dentro e fora da abertura de trabalho. Posicionar os equipamentos e materiais de modo a minimizar a perturbação do fluxo de ar na abertura de trabalho. Os operadores devem ser treinados adequadamente para usar corretamente as cabines e garantir sua segurança e a integridade do produto ou cultura. 5.2.3.


Limpar e desinfetar as áreas de trabalho após o uso com desinfetante apropriado e não corrosivo de acordo com as instruções do fabricante. Examinar regularmente as grades que protegem os filtros e limpá-las com uma gaze embebida em desinfetante. Para cabines de fluxo laminar, a frente do filtro deve ser limpa com um aspirador regularmente, tomando cuidado para não danificar o meio do filtro. Cabines de segurança devem ser fumegadas antes da troca do filtro ou de serviços. Após a limpeza das cabines, lâmpadas UV podem ser utilizadas para a desinfecção. As lâmpadas UV devem ser regularmente limpas e trocadas de acordo com as instruções do fabricante. 5.2.4.

Manutenção e inspeção

Usar cabines de proteção que sejam apropriadas ao uso pretendido e as condições ambientais do laboratório. A eficiência de uma cabine de proteção deve ser averiguada por uma pessoa qualificada no momento da chegada do equipamento e após intervalos regulares de tempo como recomendado pelo fabricante, bem como após quaisquer reparos ou modificações. Verificações periódicas de ausência de contaminação por microrganismos devem ser realizadas analisando as superfícies de trabalho e paredes das cabines. Uma verificação periódica do número de microrganismos transportados pelo ar deve ser realizada durante o funcionamento dos filtros quando do uso do equipamento. Por exemplo, expor muitas placas de Petri contendo meio de cultura de ágar não seletivo (e.g. A) em cada cabine por 30 minutos. Outros métodos podem ser utilizados. 5.3.

Balanças e diluidores gravimétricos

5.3.1.

Uso e medição de incertezas

Balanças são principalmente utilizadas para pesagem de porções teste de amostras a serem analisadas e dos componentes do meio de cultura e reagentes. Além disso, elas podem ser utilizadas para realizar medidas de diluição de líquidos por massa. Diluidores gravimétricos são instrumentos eletrônicos que consistem de uma balança e um dispensador programável de líquidos e usados durante a preparação de suspensões iniciais de amostras; eles funcionam adicionando diluente a uma amostra ajustado a uma razão. A subamostra é então pesada a uma tolerância

8

especificada na aplicação, e o diluidor é ajustado para adicionar diluente suficiente para atingir a razão desejada (e.g. 9 para 1 para diluições decimais). Um laboratório de análise microbiológica de alimentos deve estar equipado com balanças de intervalos e incertezas de medição adequados aos diferentes produtos a serem pesados. A menos que determinado o contrário, o erro máximo aceitável deve ser de 1% ou melhor quando pesando amostras teste. Colocar o equipamento sobre uma superfície horizontal estável, ajustada adequadamente para garantir sua nivelação e protegê-la de vibração. 5.3.2.


O equipamento deve ser limpo e desinfetado, após o uso ou após o derramamento durante a pesagem, com desinfetantes apropriados e não corrosivos. 5.3.3.

Avaliação de desempenho e calibração

O desempenho do sistema de balança deve ser regularmente verificado durante o uso e após a limpeza com pesos calibrados por uma pessoa treinada. A calibração deve ser averiguada ao longo de todo intervalo de peso mensurável por uma pessoa qualificada a uma frequência dependente do uso. Averiguação de pesos pode ser realizada imediatamente após a calibração da balança. 5.4.

Homogeneizadores, liquidificadores e misturadores

5.4.1.

Descrição

Este equipamento é utilizado para preparar a suspensão inicial de uma amostra teste de produtos não líquidos. Os seguintes aparelhos podem ser utilizados: -

Um misturador peristáltico (stomacher) com sacolas estéreis, possivelmente com um dispositivo para ajuste de velocidade e tempo; ou

-

Um homogeneizador rotacional (liquidificador), com velocidade entre 8.000 r/min e 45.000 r/min inclusive, com recipientes de vidro ou metal esterilizáveis e tampáveis; ou

-

Um misturador vibracional (pulsifier) com sacolas estéreis; ou

-

Outro sistema de homogeneização com eficiência equivalente.

Em alguns casos, a homogeneização manual pode ser realizada usando-se esferas de vidro de diâmetro apropriado (aproximadamente 6 mm; ver ISO 6887-2 a ISO 6887-4 e ISO 8261). 5.4.2.

Uso

O tempo comum de funcionamento do homogeneizador peristáltico é de 1 min a 3 min (ver ISO 6887-2 a 68874 e ISO 8261 para alimentos específicos). Não usar este tipo de aparelho para alimentos do tipo: -

Produtos propensos a perfurar as sacolas (presença de partes cortantes, duras ou secas);

-

Produtos difíceis de misturar por causa de sua textura (e.g. salames).

9

O liquidificador deve operar por um tempo de modo que o número total de rotações esteja entre 15.000 r/min e 20.000 r/min. Mesmo em homogeneizadores mais lentos, este tempo não deve exceder 2,5 minutos. O misturador vibracional pode ser utilizado para a maioria dos alimentos, incluindo-se produtos duros e secos. O tempo de funcionamento usual é de 0,5 a 1 minuto. Caso os microrganismos estejam dentro de estruturas bastante internas, as amostras podem ser cortadas em pequenos pedaços antes do processamento. Esferas de vidro podem ser utilizadas para a preparação, por agitação, da suspensão inicial de certos produtos viscosos e espessos, em particular para certos produtos lácteos (ver padrões específicos). 5.4.3.


Limpar e desinfetar homogeneizadores peristálticos e vibracionais regularmente e após vazamentos ou perfurações de qualquer sacola. Para homogeneizadores rotacionais, limpar e esterilizar os recipientes de vidro ou metal após cada uso. 5.4.4.

Manutenção

Inspecionar e manter o equipamento de acordo com as instruções do fabricante. 5.5.

pHmetro

5.5.1.

Descrição

Um pHmetro é utilizado para medir a diferença potencial, a uma determinada temperatura, entre a medição de um eletrodo de medição e um de referência, ambos os eletrodos introduzidos no produto. Este deve ser capaz de medir com uma acurácia de ± 0,05 unidades de pH e com uma resolução de 0,01 unidade de pH. O pHmetro deve ser provido com compensação manual ou automática de temperatura. NOTA: O eletrodo de medição e o de referência são normalmente unidos em um sistema único de eletrodo.

5.5.2.

Uso

Um pHmetro é utilizado para medir o valor de pH de meios de cultura e reagentes para verificar se ajustes são necessários durante o preparo e como verificação de qualidade após a esterilização. Ele pode ser utilizado para medir o valor de pH de amostras e suspensões de amostra. O uso de um pHmetro é discutido no padrão específico para o produto a ser analisado, no qual a condição de determinação de valor de pH e o valor de pH a ser ajustado são especificados. Ajustar o pHmetro como indicado nas orientações do fabricante e medir o valor de pH a uma temperatura padronizada, e.g. 25ºC. Ler o valor de pH após a estabilização da leitura pelo eletrodo. Tomar nota do valor de pH com duas casas decimais. NOTA: A leitura pode ser considerada estável com o valor de pH medido após um período de 5 segundos varia não mais que 0,02 unidades de pH. Usando eletrodos em boas condições, o equilíbrio é atingido normalmente em 30 segundos.

5.5.3.

Verificação e calibração

Verificar o pHmetro de acordo com as instruções do fabricante, usando ao menos dois, mas preferencialmente três, soluções tampão padrão diariamente antes de utilizá-lo. Definir o máximo erro permitido para esta verificação, dependendo do uso. As soluções padrão devem ter valores de pH especificado com duas casas decimais a uma determinada temperatura (em geral, pH 7,00 e pH 4,00 e/ou pH 9,0 a 25ºC, de acordo com as instruções do fabricante). Os padrões utilizados devem abranger os valores de pH a serem medidos. Após a verificação do pHmetro com duas soluções tampão padrão, o pH deve ser verificado usando o terceiro tampão, como tampão controle, e.g. pH 5 ou 8. 10

Calibrar o pH quando as medições apresentarem-se além dos erros máximos permitidos e de acordo com as instruções do fabricante. Este aferimento pode se sucedido por uma calibração que permite a medida estimada da incerteza do pHmetro. 5.5.4.

Manutenção

Verificar e manter os eletrodos de acordo com as instruções do fabricante. Se necessário, particularmente, monitorar regularmente: -

a condição do eletrodo quanto ao desgaste e condição de limpeza, e

-

o tempo de resposta e estabilidade.

Enxaguar os eletrodos com água destilada ou deionizada após a utilização. Levando em consideração o desgaste e condição de limpeza dos eletrodos, limpá-los regularmente de acordo com as instruções do fabricante. Guardar os eletrodos de acordo com as orientações do fabricante. 5.6.

Autoclave

5.6.1.

Descrição

Uma autoclave faz com que uma câmara chegue a determinada temperatura graças a vapor de água e é utilizada para a destruição de microrganismos. Uma autoclave deve ser equipada com: -

ao menos uma válvula de segurança,

-

uma torneira de drenagem,

-

um dispositivo de regulagem permitindo a manutenção da temperatura no interior da câmara com intervalo de variação de ± 3°C da temperatura alvo (levando em consideração a incerteza da medição do par termoelétrico de medição), e

-

uma sonda de temperatura ou um par termoelétrico de registro,

Ela deve ser também equipada com um temporizador e um medidor de temperatura. 5.6.2.

Uso

Com esterilização por vapor, todo ar é expelido antes da pressurização. Se a autoclave não estiver equipada com um dispositivo de expulsão de ar para pressurização, torna-se necessária a remoção do ar até que um jato contínuo de vapor seja emitido. Para a destruição de microrganismos, a câmara saturada com vapor deve estar a uma temperatura de ao menos 121°C. Não use a autoclave concomitantemente para esterilizar equipamentos limpos (e/ou meios de cultura) e para descontaminar equipamentos utilizados (e/ou meios de cultura usados). É preferível utilizar autoclaves separadas para materiais contaminados e materiais limpos. Após a esterilização em autoclave, todos os materiais e equipamentos devem ser resfriados dentro da autoclave antes da remoção. Por razões de segurança, não retirar os materiais autoclavados antes quee a temperatura tenha caído até 80°C aproximadamente.

11

5.6.3.

Manutenção

Limpar a câmara, secar filtros e selamento de portas regularmente. Verificar se as portar selam por completo. Providenciar a drenagem de descalcificação, se necessário, a intervalos regulares de tempo. Seguir as instruções do fabricante. 5.6.4.

Verificação e calibração

A autoclave deve ser mantida em boas condições de funcionamento e deve ser inspecionada regularmente por pessoal qualificado para tal função de acordo com as instruções do fabricante. Manter os instrumentos de monitoramento em boas condições de funcionamento e verifica-los com regularidade. A validação inicial deve conter estudos de desempenho para cada ciclo de operação e cada configuração utilizada na prática. Este processo deve ser repetido após modificação e reparo significante. Um número suficiente de sensores de temperatura deve ser colocado junto do material introduzido de modo a demonstrar a penetração adequada do calor em todos os pontos. Validações e revalidações devem considerar a adequação dos tempos de aquecimento e resfriamento, bem como das temperaturas de esterilização. Para cada carregamento, no mínimo, um indicador de processo deve ser adicionado ao centro do material para verificar o aquecimento durante o processo, quando não há disponível um registro rastreável da eficiência do processo. 5.7.

Preparador de meios

5.7.1.

Descrição

O preparador de meio é projetado principalmente para a esterilização de grandes volumes de meio (>1litro). Ele consiste em um recipiente de aquecimento, uma câmara de água e um dispositivo de homogeneização. O equipamento deve também ser provido de um dispositivo de controle de temperatura, pressão, temporizador e válvula de segurança. Além disso, a unidade deve possuir uma trava de segurança que evita a abertura até que a temperatura esteja inferior a 80°C. 5.7.2.

Uso

Sempre seguir as orientações do fabricante. O processo inteiro de produção ocorre dentro do aparelho. Após a adição de todos os ingredientes, estes são dissolvidos por mistura e aquecimento. Isto é seguido por esterilização. 5.7.3.

Manutenção

Lavar o preparador e enxaguar bem com água pura entre cada lote de meio. 5.7.4.

Verificação

O preparador deve ser mantido em boas condições de funcionamento e ser inspecionado regularmente por pessoal qualificado de acordo com as instruções do fabricante. Manter os instrumentos de monitoramento em bom estado de funcionamento e verificar o seu desempenho regularmente. A validação inicial deve conter estudos de desempenho para cada ciclo de operação e cada configuração utilizada na prática. Este processo deve ser repetido após modificação e reparo significante. Duas sondas de temperatura, uma ao lado da sonda controle e outra longe desta, podem ser utilizadas para demonstrar a uniformidade do aquecimento. A temperatura e duração de cada ciclo devem ser verificadas.

12

5.8.

Estufa/Incubadora

5.8.1.

Descrição

Uma estufa/incubadora consiste em uma câmara com isolamento que permita ser mantida a uma temperatura estável e uniformemente distribuída dentro dos erros permissíveis de temperatura especificados no método de análise. 5.8.2.

Uso

As estufas devem ser providas de um sistema de regulação que permita manter a temperatura e outros parâmetros estáveis para todo volume de trabalho. Definir o volume de trabalho de modo a atingir isto. Se a temperatura ambiente é próxima ou maior que a da estufa/incubadora, esta deve possuir um sistema de refrigeração. As paredes da estufa devem ser protegidas do sol. Se possível, as estufas não devem ser preenchidas de uma única vez, porque isto tornará o alcance e estabilização da temperatura pelos meios de cultura, bastante mais lento independentemente do tipo de estufa (por convecção de ar ou outros). Evitar deixar a porta da estufa aberta por longos períodos. Quando preenchendo a estufa, prestar atenção à circulação do ar (ver 10.2.4.). 5.8.3.

Limpeza e sanitização

Limpar e desinfetar regularmente as paredes internas e externas da estufa e, se for o caso, remover a poeira do sistema de ventilação. 5.8.4.

Verificação

Verificar a estabilidade e homogeneidade de distribuição da temperatura com o volume de trabalho em curso usando termômetros ou par termoelétrico de precisão conhecida e intervalo de temperatura adequados. Usar a informação para determinar âmbito de variação de temperatura de funcionamento e a melhor posição para o termômetro monitorar as temperaturas de funcionamento. Por exemplo, para uma temperatura alvo de 37°C ± 1°C quando os dados de perfil mostram uma variação de 36,8°C a 37,3°C ao longo da estufa, então o intervalo de funcionamento deve ser reduzido para 36,2°C a 37,7°C para garantir que todas as partes da estufa alcancem a temperatura almejada de 37°C. Este processo deve ser repetido a cada reparo ou modificação significantes. A temperatura de funcionamento deve ser verificada com um ou mais termômetros de máxima e mínima ou pares termoelétricos de registro, por exemplo. O termômetro ou par termoelétrico de registro utilizados para monitoramentos de rotina da estufa devem ser fixos em uma posição definida a partir do perfil de dados de modo a atingir a temperatura desejada. Verificar a temperatura da estufa em todos os dias de trabalho. Por esta razão, cada estufa deve possuir ao menos um instrumento de medição, com bulbo imerso em glicerol (ou outro líquido de imersão) dentro de um recipiente vedado. Outros sistemas de verificação de desempenho equivalente podem ser utilizados.

13

5.9.

Refrigeradores, salas refrigeradas

5.9.1.

Descrição

Existem câmaras que permitem o armazenamento sob resfriamento. Para a conservação de amostras de alimentos para análise, a temperatura deve ser 3°C ± 2°C (máximo erro permitido), exceto para usos específicos. Para outros usos, a temperatura, a menos que especificado de outra maneira, deve ser de 5°C ± 3°C. 5.9.2.

Uso

Para evitar contaminação cruzada, usar câmaras diferentes, ou ao menos compartimentos diferentes, proporcionando separação física durante o armazenamento de: -

meios de cultura não inoculados e reagentes;

-

amostras teste, e

-

culturas de microrganismo e meio incubado.

Preencher refrigeradores, resfriadores e salas refrigeradas de modo a manter a circulação apropriada e diminuir o risco de contaminação cruzada. 5.9.3.

Verificação

Verificar a temperatura de cada câmara de trabalho usando um termômetro ou sonda permanentemente instalada. A precisão necessária do dispositivo de monitoramento de temperatura depende do propósito ao qual a unidade se destina. 5.9.4.

Manutenção e limpeza

Realizar os seguintes procedimentos de manutenção em intervalos regulares para garantir o funcionamento adequado: -

remoção da poeira das pás do motor e da parte externa das placas de troca de calor;

-

descongelamento;

-

limpeza e desinfecção do interior das câmaras.

5.10.

Congeladores e ultracongeladores

5.10.1. Descrição Um congelador é uma câmara que permite o armazenamento de artigos congelados. A temperatura, a menos que especificada de maneira diferente, deve ser abaixo de -15°C, preferencialmente, abaixo de -18°C para amostras de alimentos. Um ultracongelador é uma câmara que permite o armazenamento de artigos profundamente congelados. A temperatura, a menos que especificada de maneira diferente, deve ser abaixo de -70°C. 5.10.2. Uso 5.10.2.1.Congelador Diferentes câmaras, ou ao menos diferentes compartimentos, devem estar disponíveis para separar fisicamente durante o armazenamento: 14

-

reagentes não inoculados;

-

amostras para análise, e

-

culturas de microrganismos.

Preencher o congelador de modo que uma temperatura suficientemente baixa seja mantida, em particular quando produtos descongelados forem introduzidos. 5.10.2.2.Ultra-congelador O principal uso é para o armazenamento de microrganismos, culturas de trabalho e/ou referência e reagentes. Preencher o congelador de modo que uma temperatura suficientemente baixa seja mantida e contaminações cruzadas entre microrganismos e reagentes sejam evitadas. 5.10.3. Verificação Verificar a temperatura de cada câmara regularmente usando um dispositivo de monitoramento de temperatura adequado. 5.10.4. Manutenção Realizar as seguintes ações de manutenção: -

remoção da poeira das pás do motor e da parte externa das placas de troca de calor (caso ível);

-

descongelamento;

-

limpeza e desinfecção do interior das câmaras.

5.11.

Banho-maria controlado via termostato

5.11.1. Descrição Um banho-maria controlado via termostato, preenchido com líquido (água, etileno glicol, etc.), com ou sem uma tampa ou outro dispositivo limitante de evaporação, é necessário para a manutenção de uma temperatura específica. O controle da temperatura é normalmente mais preciso que em uma estufa, permitindo erros máximos de ± 0,5°C ou melhor. As temperaturas de trabalho e erros máximos permitidos são estipuladas em cada método individualmente. Um sistema de resfriamento é necessário para manter a temperatura perto ou abaixo da temperatura ambiente. 5.11.2. Uso Os principais usos são os seguintes: -

incubação a temperaturas constantes de meios de cultura inoculados;

-

manutenção de meio ágar estéril fundido durante a preparação de meios;

-

aclimatação de meio ágar estéril fundido para uso em métodos específicos;

-

preparação de suspensões iniciais de amostras ou soluções a temperaturas controladas;

-

tratamento térmico de suspensões iniciais de amostras a temperatura controlada (e.g. pasteurização).

15

Quando uma temperatura precisa é necessária, o banho-maria deve ser equipado com um sistema de circulação de água e regulação de temperatura. Toda movimentação de líquido não pode provocar dispersão de gotas. Banhos-maria com tampa são recomendados para usos de alta-temperatura. Devem ser utilizadas tampas convexas que permitam a drenagem da água condensada. Para a incubação de meio inoculado, manter o nível do líquido do banho de modo que este esteja 2 cm acima do nível do meio de cultura incubado. Outros recipientes devem ser acondicionados no banho de modo que seus conteúdos fiquem abaixo da linha da superfície do líquido. A profundidade de imersão deve impedir a entrada de água pela abertura do recipiente. Dispositivos que mantenham a estabilidade dos recipientes podem ser necessários, por exemplo estantes. Todos os recipientes devem ser secos após a remoção do banho-maria e antes de usos posteriores. 5.11.3. Verificação Verificar a estabilidade e homogeneidade da temperatura do banho antes do uso inicial e após quaisquer reparos ou modificações que surtam efeito sobre o controle de temperatura. Monitorar cada banho com termômetro, par termoelétrico ou dispositivo de registro de um mínimo de temperatura de medida adequada (ver 5.28.2.), e independentes do sistema automático de regulagem de temperatura. Um mostrador digital pode ser utilizado desde que sua precisão e resolução sejam averiguadas. Monitorar a temperatura do banho durante cada uso e diariamente para períodos de longa duração de incubação. 5.11.4. Manutenção Banhos-maria devem ser preenchidos com líquido conforme orientações do fabricante. Para incubação de culturas deve-se preferir água destilada ou deionizada. Verificar regularmente o nível de líquido a fim de garantir o correto funcionamento do aparelho e imersão satisfatória de itens no banho. O nível de liquido deve sempre cobrir o nível do elemento em aquecimento. Banhos-maria devem ser esvaziados, limpos, desinfetados e preenchidos regularmente e a uma frequência dependente do uso ou após vazamentos. 5.12.

Aquecedores a vapor, incluindo banhos-maria de fervura

5.12.1. Descrição Aquecedores a vapor e banhos-maria de fervura consistem de elementos de aquecimento circundados por água em um recipiente com uma tampa. Nos aquecedores a vapor, cria-se vapor a pressão atmosférica; em banhos-maria de fervura aquece-se a água até próximo à temperatura de ebulição, com ou sem produção de vapor. 5.12.2. Uso Os principais usos são: -

fundir meio de cultura com agar;

-

preparação de meios termo-instáveis; 16

-

redução de contaminação de pequenos itens de equipamentos entre usos.

Um nível adequado e seguro de água deve estar presente no recipiente para garantir que os elementos de aquecimento estejam permanentemente cobertos. Uma autoclave com aparato livre de vapor também pode ser utilizada. 5.12.3. Manutenção Manter os aquecedores a vapor e banhos-maria de fervura limpos. Se necessário, descalcificação regular pode ser realizada a uma frequência dependente da dureza local da água. 5.13.

Forno de esterilização

5.13.1. Descrição Um forno de esterilização é uma câmara capaz de manter a temperatura de 160°C a 180°C para a destruição de microrganismos por calor seco. 5.13.2. Uso Apenas itens resistentes feitos em vidros ou metal devem ser esterilizados em forno de esterilização; não usar para plástico e produtos emborrachados. Antes de esterilizar limpas todos os utensílios de metal ou vidro a serem esterilizados no forno. No caso de esterilização de vidrarias volumétricas, verificar constantemente a precisão das medições. A temperatura deve ser uniforme ao longo da câmara. O forno deve ser equipado com um termostato e um termômetro ou instrumento de registro de temperatura de acurácia adequada. Ele deve ser equipado com um indicador de duração, temporizador ou programador. Uma vez atingida a temperatura de funcionamento, o processo de esterilização deve perdurar por 1h a 170°C ou um binômio tempo/temperatura equivalente. Após a esterilização, a fim de evitar rachaduras, as vidrarias devem ser mantidas no forno até que se resfriem antes de serem removidas. 5.13.3. Verificação Verificar a estabilidade e homogeneidade da temperatura do forno antes do uso inicial e após quaisquer reparos ou modificações que possam surtir efeito no controle de temperatura. O forno deve ser provido de um termômetro, par termoelétrico ou instrumento de registro de temperatura, calibrado e de precisão apropriada independente do sistema automático de regulação da temperatura. O instrumento de monitoramento deve ter uma resolução de 1°C ou maior na temperatura utilizada pelo forno. A temperatura do forno deve ser verificada e registrada a cada uso. 5.13.4. Manutenção Limpar as superfícies internas do forno quando requeridas. 17

5.14.

Forno de microondas

5.14.1. Descrição Um forno de microondas é um instrumento que permite o aquecimento de itens através da energia de microondas a pressão atmosférica. 5.14.2. Uso Usar os meios atualmente disponível apenas para aquecer líquidos e fundir meio de cultura com ágar. ATENÇÃO – Não aquecer mios contendo componentes termolábeis em forno de microondas a menos que tenha sido mostrado que isto não afeta o desempenho do meio. Nenhum estudo foi feito sobre a eficiência do microondas na esterilização de meio de cultura e os fornos de microondas não devem ser utilizados para esta finalidade.

O forno deve ser capaz de aquecer líquidos e meios de cultura de uma maneira controlada, via ciclos de emissão de microondas. A distribuição das microondas deve ser homogênea e evitar zonas de superaquecimento. Fornos equipados com plataformas giratórias ou agitadores fornecem melhor distribuição de calor. Não usar equipamentos metálicos, inclusive selos metálicos. Abrir as tampas das garrafas antes do aquecimento. Aquecimentos por períodos maiores a menores potências apresentam melhor distribuição de calor. ATENÇÃO – manipular os itens aquecidos com cautela. Os conteúdos podem estar superaquecidos e transbordar ou explodir as garrafas.

Quando fundir meios com ágar, usar uma potência baixa (e.g. ciclo de descongelamento) e um recipiente com água (e.g. 50 ml a 100 ml de água em um recipiente microondas-resistente) são recomendados para evitar superaquecimento. Antes da remoção de dentro do microondas, recomenda-se deixar 5 min em descanso após o aquecimento. 5.14.3. Verificação Tempos e potências devem ser adequados a diferentes volumes de líquidos e meios de cultura rotineiramente utilizados a fim de garantir o melhor desempenho e evitar superaquecimento de produtos sensíveis. 5.14.4. Manutenção Limpar o forno imediatamente após qualquer derramamento, e também a intervalos regulares dependendo do uso. A vedação da porta do forno deve ser averiguada quanto a sua integridade e o forno deve ser avaliado quanto a eventuais vazamentos de radiação, em intervalos regulares. 5.15.

Lavadora de vidrarias

5.15.1. Descrição Lavadoras de vidrarias são máquinas controladas eletronicamente que se destinam a lavagem de vidrarias em geral, e podem ser programadas para diferentes ciclos de lavagem e enxague (e.g. água deionizada ou destilada ou ácido). Dispositivos de lavagem de pipetas de vidro são lavadoras especiais projetadas para lavar os orifícios estreitos das pipetas.

18

5.12.2. Uso Muitos tipos de lavadoras de vidro estão disponíveis, e estas devem em geral ser instaladas e utilizadas segundo as recomendações do fabricante. 5.15.3. Verificação Verificar a eficiência da limpeza por inspeção visual e, para aplicações críticas, realizar testes para garantir que a vidraria esteja livre de substâncias inibitórias. Resíduos alcalinos e ácidos podem ser verificados usando-se uma solução indicadora de pH; Um pH entre 6,5 e 7,3 deve ser alcançado. 5.15.4. Manutenção Programar a manutenção regular de acordo com as especificações do fabricante e a frequência adequada. Manutenções mais frequentes podem ser necessárias para equipamentos com alta taxa de utilização ou em regiões com água dura. 5.16.

Microscópio óptico

5.16.1. Descrição Há muitos tipos diferentes de microscópio: monocular, binocular, com um VDU, uma câmera ou equipamento de fluorescência, etc. e com uma fonte de luz interna ou externa. Para análises bacteriológicas, objetivas com aumento de 10x (lentes secas) a cerca de 100x (usadas com óleo de imersão) são utilizadas para obter um aumento geral de 100x a 1000x. Microscopia de contraste de fase também é bastante útil para análises de “preparações húmidas”. 5.16.2. Uso Ajustar o microscópio de acordo com as instruções do fabricante. O eixo óptico de luz advindo de uma lâmpada de luz de alta intensidade deve ar pelo centro do condensador, pela lâmina e pelas lentes objetivas atingindo os olhos de modo a impedir distorções esféricas e cromáticas. 5.16.3. Manutenção Seguir as recomendações do fabricante no que diz respeito à limpeza, armazenamento e manutenção. Impedir a condensação que ocorre quando há alta umidade do ar, uma vez que isto pode levar à deterioração das lentes. Todos os dias ou após o uso, retirar o óleo de imersão das lentes e partes relacionadas utilizando um tecido próprio para tal função. Usar o solvente recomendado pelo fabricante. Remover regularmente a gordura depositada pelos cílios e sobrancelhas na lente ocular. O sistema óptico pode ser facilmente danificado e, a manutenção deve ser preferencialmente por uma assistência técnica autorizada. 5.17.

Bico de Bunsen ou queimadores

5.17.1. Descrição Bicos de Bunsen produzem uma chama estreita. Variando a quantidade de ar a ser misturado ao gás, pode-se modular a intensidade do calor da chama. Queimadores utilizam gás ou eletricidade para produzir calor vermelho sem chama para esterilizar alças e bastões retos usados na manipulação de culturas.

19

5.17.2. Uso Um queimador a gás é utilizado principalmente para a esterilização de alças de metal e bastões aquecendo-os até a incandescência e para flambagem e esterilização de pequenas partes de equipamentos resistentes. O queimador é utilizado para esterilização de alças de metal, bastões retos e agulhas de inoculação e é preferível quando da manipulação de patógenos por evitar dispersão diminuindo o risco de contaminação cruzada. Bicos de Bunsen podem produzir muito calor e perturbar a circulação de ar no laboratório. Técnicas assépticas podem ser realizadas sem um bico de Bunsen, apenas utilizando materiais descartáveis. Em cabines de proteção, o uso de bicos de Bunsen deve ser evitado, porque eles podem interferir de maneira inaceitável no fluxo laminar. Neste caso, o uso de instrumentos descartáveis é recomendado. 5.17.3. Manutenção Limpar regularmente e desinfetar queimadores e bicos de Bunsen, particularmente se culturas de microrganismos tiverem espirrado nos dispositivos. 5.18.

Dispensadores para meios de cultura e reagentes

5.18.1. Descrição Um dispensador é um instrumento ou dispositivo utilizado para distribuir meios de cultura ou reagentes em tubos de ensaio, garrafas ou placas de Petri. Estes dispositivos variam desde simples cilindros, pipetas e seringas manuais a seringas automáticas e bombas peristálticas programadas e eletronicamente controladas com distribuição automática. 5.18.2. Uso O equipamento limpo utilizado para a distribuição de meios de cultura e reagentes deve ser livre de substâncias inibitórias. Utilizar tubos separados para meios de cultura seletivos de modo a minimizar o transporte de substâncias inibitórias. No caso da distribuição precisar ser efetuada assepticamente, as partes do dispensador que entram em contato com o líquido devem ser esterilizadas. 5.18.3. Verificação A medida de incerteza do instrumento ou dispositivo deve ser apropriada para o máximo erro permitido para o volume distribuído, o qual não deve exceder ± 5%. O máximo erro permitido na distribuição de volumes de fluidos de diluição decimal é de ± 2%. Verificar o volume distribuído antes do uso inicial e regularmente de acordo com um planejamento documentado, e sempre após ajustes que possam surtir efeito no volume distribuído. 5.18.4. Limpeza e manutenção Limpar a superfície externa do distribuidor após cada uso. Lavar e enxaguar abundantemente todas as partes do dispensador que entram em contato com o produto e esteriliza-las caso seja necessário para a distribuição de líquidos estéreis. Não utilizar desinfetantes nas superfícies que entram em contato com o produto a ser distribuído uma vez que eles podem possuir propriedades inibitórias.

20

Todos os dispensadores automáticos devem ser mantidos em boas condições de funcionamento através de manutenções regulares, de acordo com as orientações do fabricante. 5.19.

Misturador do tipo vórtice

5.19.1. Descrição Este instrumento facilita a mistura homogênea de meios líquidos (e.g. diluições decimais e amostras de líquido para teste) ou suspensões de células bacterianas em um líquido. A mistura é provocada por movimentos rotacionais excêntricos do conteúdo de um tubo ou recipiente (produzindo um vórtice). 5.19.2. Uso Pressionar a base do tubo ou recipiente contendo o líquido contra o misturador. A velocidade de mistura é controlada variando a velocidade do motor ou o ângulo de contato com o misturador. O analista deve garantir que não haja espirramento ajustando a velocidade adequadamente e segurando o tubo a uma distância do topo de aproximadamente um terço de seu comprimento para garantir o melhor controle do tubo evitando a subida do líquido. Cuidados adequados devem ser tomados para minimizar a liberação de aerossóis quando da utilização de misturadores do tipo vórtice. 5.19.3. Verificação A mistura adequada é evidenciada pela formação de um vórtice no interior do líquido durante o funcionamento do aparelho. 5.19.4. Manutenção Manter o aparelho limpo. No caso de espirramento, descontaminar o equipamento usando o desinfetante apropriado. 5.20.

Dispositivo de contagem de colônias

5.20.1. Descrição Instrumentos manuais de contagem de colônias usam um dispositivo dependente de pressão e normalmente emitem uma indicação sonora a cada contagem e um visor digital totalizando a contagem. Eles podem ser dispositivos simples como canetas ou consistir em uma plataforma iluminada com grades calibradas e lupa de aumento para auxiliar a contagem de colônias. Contadores eletrônicos automatizados incorporam analisadores de imagens e funcionam através de combinações de sistemas de hardware e software fazendo-se uso de câmeras e monitores. 5.20.2. Uso Seguir as recomendações do fabricante. Ajustar a sensibilidade do contador automático para garantir que todas as colônias alvo sem contabilizadas. Contadores eletrônicos automatizados precisam de programas separados quando utilizados para contar colônias obtidas em diferentes tipos de ágar e matérias-primas, e para contagens de superfície e de colônias em métodos pour plate para garantir a discriminação adequada das colônias alvo.

21

5.20.3. Verificação A verificação deve ser feita manual e regularmente de modo a garantir que contagens precisas sejam obtidas utilizando o contador de colônias. Além disso, contadores de colônias automatizados devem ser verificados todos os dias com placas de calibração contendo um número conhecido de partículas ou colônias contáveis. 5.20.4. Manutenção Manter o equipamento limpo e livre de pó; evitar arranhões nas superfícies essenciais para a contagem. Programar manutenções regulares dos contadores eletrônicos que possuam analisadores de imagens como especificado pelo fabricante, a uma frequência adequada. 5.21.

Equipamento para cultivo em atmosfera modificada

5.21.1. Descrição Este pode ser uma jarra hermeticamente fechada ou outro qualquer equipamento apropriado que permita a formação de atmosfera modificada (e.g. para anaerobiose) ao longo de todo o tempo de incubação do meio de cultura. Outros sistemas de desempenho equivalente, como câmaras de anaerobiose, podem ser utilizados. Seguir as recomendações do fabricante quanto à instalação e manutenção. 5.21.2. Uso A composição da atmosfera desejada pode ser atingida pela adição de uma mistura de gás (e.g. advindo de cilindros de gás) após a retirada do ar da jarra, pelo deslocamento da atmosfera em uma cabine ou por outro meio apropriado (como pacotes de gás disponíveis comercialmente). Em geral, a incubação anaeróbica requer uma atmosfera com menos de 1% de oxigênio, 9% a 13% de dióxido de carbono e a incubação microaeróbica requer de 5% a 7% de oxigênio e aproximadamente 10% de dióxido de carbono. As condições podem exigir modificação dependendo do microrganismo a ser cultivado. 5.21.3. Verificação Colocar um indicador químico ou biológico em cada câmara para monitorar a natureza da atmosfera durante cada uso. O crescimento de um microrganismo controle ou a mudança de cor de um indicador químico indicam que as condições apropriadas de incubação foram alcançadas. 5.21.4. Manutenção No caso de um catalisador ser utilizado, regenerá-lo de acordo com as instruções do fabricante. Na presença de válvulas, limpá-las e lubrifica-las para garantir o funcionamento adequado substituindo-as caso necessário. Limpar e desinfetar o equipamento regularmente. 5.22.

Centrífugas

5.22.1. Descrição Centrífugas são dispositivos eletrônicos ou mecânicos que se utilizam da força centrípeta para separar partículas em suspensão, incluindo microrganismos, de fluidos.

22

5.22.2. Uso Em alguns casos, a concentração de microrganismos alvos é atingida pela centrifugação de amostras líquidas a fim de formar um precipitado, que pode ser ressuspendido em líquido e sujeito à análise subsequente. Tomar as providências necessárias para evitar a formação de aerossóis e de contaminação cruzada, usando o equipamento adequadamente e utilizando tubos ou potes próprios para centrifugação, vedados e estéreis. 5.22.3. Verificação Quando a velocidade de centrifugação é crítica ou especificada para alguma aplicação, o indicador de velocidade ou parâmetros devem ser verificados regularmente usando-se tacômetro independente e calibrado, e após quaisquer modificações substanciais. 5.22.4. Manutenção Limpar e desinfetar as centrífugas regularmente ou após quaisquer derramamentos de culturas de microrganismos ou de amostras potencialmente contaminadas. As centrífugas devem ser submetidas à manutenção regularmente. 5.23.

Manta e chapa de aquecimento

5.23.1. Descrição Mantas ou chapas de aquecimento são dispositivos de aquecimento controlados por termostato. Algumas mantas ou chapas de aquecimento compõe sistemas de agitação. 5.23.2. Uso Mantas ou chapas de aquecimento possuem equipadas com sistemas de agitação magnética são utilizadas para aquecer grandes volumes de líquido como meios de cultura. Não usar mantas ou chapas de aquecimento sem sistemas de agitação para preparar meios de cultura. 5.23.2. Manutenção Limpar quaisquer derramamentos assim que a unidade for resfriada. 5.24.

Semeador helicoidal

5.24.1. Descrição Um semeador helicoidal é um dispensador que distribui um volume predeterminado de líquido sobre uma superfície de uma placa de ágar em rotação. O braço de distribuição move-se do centro de uma placa para as bordas externas em um espiral de Arquimedes. O volume aplicado diminui gradativamente com a movimentação do braço do centro para as bordas da placa, de modo que haja uma relação inversa entre o volume depositado e o radio da espiral. O volume total de amostra distribuída é conhecido e constante. Uma bomba de vácuo é necessária para o carregamento de distribuição de líquidos. 5.24.2. Uso O equipamento é utilizado para distribuir uma amostra liquida, amostra homogeneizada ou diluição sobre a superfície de uma placa de ágar para determinar a contagem de colônias. Após a incubação, as colônias se desenvolvem ao longo da linha onde o líquido foi depositado. O número de colônias é contado usando uma grade de contagem fornecida junto com o equipamento e o cálculo é efetuado.

23

A superfície das placas de ágar a serem utilizadas com o semeador deve estar livre de bolhas de ar e niveladas. As placas devem ser pré-secas antes do uso para evitar que elas tenham excesso de umidade. Os sistemas de distribuição devem ser desinfetados e enxaguados antes de cada amostra e após cada uso. 5.24.3. Verificação Verificar o ângulo do bico de aplicação diariamente utilizando vácuo para segurar uma tampa de placa. A tampa da placa deve estar paralela e a 1 mm da superfície do ágar. O padrão de distribuição deve ser verificado usando-se uma tinta lavável de distribuição. O padrão do espiral deve ser mais denso no centro onde a deposição se inicia e tonar-se menos densa à medida que o bico dispensador se afasta. A zona limpa da placa deve ser central e de aproximadamente 2,0 cm de diâmetro. Uma verificação diária deve ser realizada para garantir que o bico dispensador está no ângulo correto em relação à superfície do ágar, através da utilização da tampa da placa e de um nível fornecido junto com o aparelho. A esterilidade do semeador helicoidal deve ser verificada semeando-se água estéril a cada série de amostras. Uma verificação gravimétrica do volume distribuído deve ser realizada regularmente com água destilada. A massa obtida deve ter o erro máximo permitido de 5% da massa esperada para o volume distribuído. 5.24.4. Manutenção A desinfecção dos tubos e bicos de distribuição pode ser realizada lavando-os com uma solução de 0,5% a 1% de cloro e, deve ser seguida de enxague com água destilada ou deionizada estéril. Entupimentos podem ser evitados, se a amostra for reservada por alguns minutos permitindo a decantação e partículas em suspensão, e usando uma porção do líquido sobrenadante. Quaisquer derramamentos devem ser limpos de imediato, além da limpeza deve ser regular. O equipamento deve ser submetido à manutenção e verificação de acordo com o uso. 5.25.

Destiladores, deionizadores e unidades de osmose-reversa

5.25.1. Descrição Estes equipamentos são utilizados para produzir água destilada ou deionizada/desmineralizada de qualidade necessária (ver ISO/TS 11133) para preparações de meios de cultura microbiológicos e reagentes e para outras aplicações laboratoriais. 5.25.2. Uso Instalar, colocar em uso e utilizar o equipamento de acordo com as instruções do fabricante, levando em consideração a localização da água no laboratório, descarte e instalações elétricas. 5.25.3. Verificação A condutividade da água pode ser verificada regularmente ou após armazenamento e deve ser menor que 25 µS/cm (equivalente a resistividade ≥ 40.000 Ωcm) para preparação de meios e reagentes.

24

Caso a água seja armazenada antes do uso ou produzida por troca iônica, verificações adequadas de contaminação microbiana devem ser realizadas de acordo com a ISO/TS 11133. 5.25.4. Manutenção Destiladores devem ser limpos e descalcificados a uma frequência dependente da dureza da água fornecida. Deionizadores e unidades de osmose-reversa devem ser mantidos de acordo com as instruções do fabricante. 5.26.

Cronômetros e dispositivos temporizadores

5.26.1. Descrição Dispositivos de cronometragem e temporizadores são instrumentos que permitem o monitoramento de períodos de tempo necessários para muitas práticas laboratoriais nas quais a duração é especificada e critica. 5.26.2. Uso Temporizadores portáteis ou de bancada, analógicos ou digitais, podem ser utilizados para monitorar a duração de procedimentos laboratoriais (e.g. aplicação de microrganismos a filmes, homogeneização de amostras) e devem estar em boas condições de uso e apresentar precisão necessária. Manusear os temporizadores pertencentes a equipamentos (e.g. autoclaves, centrífugas, homogeneizadores) de acordo com as instruções do fabricante. Estes temporizadores devem apresentar precisão necessária. 5.26.3. Verificação Verificar todos os temporizadores utilizados nos procedimentos laboratoriais nos quais a duração mostra-se crítica ao resultado regularmente e após quaisquer reparos significativos. 5.26.4. Manutenção Limpar regularmente e verificar o correto funcionamento. Os temporizadores pertencentes a equipamentos devem ser verificados e submetidos à manutenção juntamente com os aparelhos aos quais pertencem. 5.27.

Pipetas e pipetadores

5.27.1. Descrição Pipetas são dispositivos de vidro ou de plástico descartáveis usados para distribuir volumes de líquido ou material viscoso; pipetas graduadas distribuem volumes medidos com uma precisão que é dependente de especificações. Pipetadores automáticos (mecânicos) com pontas de plástico são dispositivos que distribuem volumes fixos ou ajustáveis de líquidos, manualmente ou por ação elétrica de um pistão. 5.27.2. Uso Descartar pipetas quebradas ou danificadas. Pipetas graduadas ou Pasteurs estéreis e ponteiras de pipetadores devem possuir um tampão de algodão hidrofóbico para evitar a contaminação quando da manipulação de culturas. Não pipetar com a boca em instalações microbiológicas, exceto para líquidos não contaminados.

25

Bulbos em pipetas graduadas e de Pasteur e ponteiras de pipetadores devem ser dos tamanhos adequados a fim de evitar vazamentos e garantir um funcionamento eficiente. 5.27.3. Verificação Verificar as pipetas graduadas para confirmar os volumes distribuídos caso o fabricante não garanta a precisão (confiança e precisão). A calibração de pipetas/pipetadores está descrita na ISO 835 (todas as partes) e ISO 8655-1. Testar novos pipetadores antes do uso e a intervalos regulares dependendo da frequência e natureza do uso, para confirmar que eles respeitam os limites máximos de erros permitidos definidos na ISO 8655-1. Realizar verificações gravimétricas usando água destilada ou deionizada para garantir que os volumes distribuídos continuam dentro dos limites máximos de erro permitidos. Verificar novos lotes de pipetas graduadas. 5.27.4. Manutenção Descontaminar e limpar/esterilizar pipetas não descartáveis e pipetadores automáticos apropriadamente após cada uso. No caso de tambores e pistões de pipetadores automáticos serem contaminados durante o uso, desmontá-los para descontaminação e limpeza. Após a remontagem, recalibrá-los. Quando isto não é possível no laboratório, enviar os pipetadores para o fabricante para serem remontados e calibrados. 5.28. Termômetros e dispositivos de monitoramento de temperatura, incluindo registradores automáticos 5.28.1. Descrição Termômetros são dispositivos contendo álcool ou mercúrio contidos em um vidro e são utilizados para medir temperaturas dentro de um intervalo para as atividades laboratoriais. Outros dispositivos de monitoramento de temperatura incluem termômetros de resistência de platina e instrumentos que utilizam par termoelétricos para medir a temperatura e fornecer indicação visual, por escrito ou registro eletrônico da variação de temperatura ao longo do tempo. Termômetros de referência e outros dispositivos de monitoramento de temperatura devem ser calibrados e certificados de acordo com padrões internacionais. Eles devem ser utilizados apenas para referência e não para atividades de rotina. Termômetros de trabalho e outros dispositivos de monitoramento de temperatura devem ser calibrados de modo a permitir a rastreabilidade de acordo com padrões nacionais ou internacionais. Dispositivos com a precisão adequada de acordo com o especificado no padrão nacional ou internacional apropriado podem também ser utilizados como termômetros de trabalho após a verificação de seu desempenho. 5.28.2. Uso Termômetros e outros dispositivos de monitoramento de temperatura devem ser capazes de medir a temperatura necessária para uma aplicação apresentando-se dentro dos limites máximos de erro permitidos. A medida da incerteza de um dispositivo de monitoramento de temperatura deve ser quatro vezes menor que o intervalo máximo de erro permitido. Por exemplo, para um erro máximo permitido de ± 1°C para determinada aplicação, a incerteza de medição deve ser de ± 0,25°C; para um erro máximo permitido de ± 0,5°C para determinada aplicação, a incerteza de medição deve ser de ± 0,125°C. A incerteza de medição de um

26

termômetro de referência deve ser levada em consideração para a determinação da temperatura de funcionamento. Termômetros ou par termoelétrico colocados em estufas devem estar imersos em recipientes contendo glicerol, parafina líquida ou propileno glicol para evitar a variação de calor quando da abertura da porta da estufa. Manter somente o bulbo dos termômetros de imersão totalmente imersos. Termômetros colocados em banhos-maria devem ser imersos de acordo com as especificações individuais, e.g. termômetros de imersão parcial devem ser mantidos imersos a profundidade especificada, por exemplo, 76 mm ou 100 mm. Não usar termômetros que apresentem quebras na coluna de álcool ou mercúrio. Termômetros de mercúrio são frágeis e, quando há risco de quebra, devem ser colocados dentro de estruturas que os protejam sem interferir na medição da temperatura. ATENÇÃO – Mercúrio é prejudicial à saúde. Remover derramamentos de acordo com a legislação nacional. 5.28.3. Verificação Termômetros de referência devem ser calibrados ao longo de todo intervalo de temperatura que medem de acordo com padrões nacionais ou internacionais antes do uso inicial e pelo menos a cada 5 anos. A calibração de pontos intermediários únicos (e.g. ponto de fusão) deve ser realizada para verificar o desempenho. Pares termoelétricos de referência devem ser calibrados cuidadosamente de acordo com padrões nacionais ou internacionais antes do uso inicial e de acordo com as instruções do fabricante. Verificações intermediárias devem ser realizadas comparando-se com o termômetro de referência. Outros dispositivos de monitoramento de temperatura (como receptores de ondas de rádio) devem ser calibrados de acordo com o determinado em padrões nacionais ou internacionais e seguindo as orientações do fabricante. Termômetros ou par termoelétricos de trabalho devem ser verificados quanto ao ponto de fusão em relação a termômetros de referência. 5.28.4. Manutenção Manter os termômetros e pares termoelétricos limpos e em perfeitas condições. Manter outros dispositivos de monitoramento de temperatura de acordo com as orientações do fabricante. 5.29.

Separador imunomagnético

5.29.1. Descrição Este dispositivo serve para separar e concentrar microrganismos de uma cultura líquida usando esferas paramagnéticas circundadas pelo anticorpo específico. Separadores manuais consistem em misturadores rotacionais capazes de funcionar a 12 r/min a 20 r/min e uma porção concentradora com uma barra magnética removível. Separadores automáticos utilizam arranjos de barras magnéticas e estantes de tubos similares a dentes de um pente. As partículas são transferidas de tubo para tubo permitindo um processo de separação completo, incluindo etapas de lavagem, ocorra automaticamente em um ambiente isolado. 5.29.2. Uso e verificação 27

Seguir a recomendações de uso fornecidas pelo fabricante e pelos padrões internacionais específicos (e.g. para E. coli O157). Para sistemas manuais, verificar a velocidade de rotação do agitador. Para sistemas manuais e automáticos, verificar se o sistema é capaz de isolar baixas concentrações de microrganismos antes de coloca-lo em uso de rotina. É importante levar em consideração que as separações manuais possuem risco de contaminação cruzada e as devidas precauções devem ser tomadas para evitar seu acontecimento. 5.29.3. Manutenção Inspecionar e manter o equipamento de acordo com as especificações do fabricante. 5.30.

Sistemas de filtração

Os sistemas de filtração devem ser como descritos na ISO 8199. 5.31.

Outros equipamentos e programas

Outros equipamentos e programas associados devem ser capazes de atingir a precisão necessária e atender às especificações relevantes aos testes em questão. Programas de calibração devem ser estabelecidos para quantidades e valores-chave quando estas propriedades surtirem efeitos nos resultados. Antes do uso rotineiro, calibrar ou verificar o equipamento para assegurar que este atende às necessidades do laboratório e às especificações do Padrão relevante. Quaisquer reconfigurações ou modificações feitas pelo laboratório ao software devem ser verificadas para garantir que com tais modificações forneçam os resultados corretos. 6.

Preparação de vidrarias e outros materiais de laboratório

6.1.

Preparação

Vidrarias e outros materiais de laboratório utilizados em microbiologia devem ser de formato apropriado, utilizados adequadamente e preparados de modo a garantir sua limpeza e/ou esterilidade até o momento do uso. Estes devem ser projetados para evitar ou limitar o contanto do manipulador com o material infectante. Tubos e garrafas devem ser tampados da maneira apropriada. Se necessário, a vidraria a ser esterilizada (e.g. pipetas) deve ser acondicionada em recipientes específicos ou embrulhados em material apropriado (papel especial, folhas de alumínio, etc.) As vidrarias a serem esterilizadas vazias devem estar limpas, livres de excesso de humidade, o que pode interferir no processo. 6.2.

Esterilização/descontaminação

6.2.1.

Geral

A temperatura e duração da esterilização/descontaminação devem ser registradas. Indicadores de esterilização podem ser utilizados para distinguir materiais esterilizados de não esterilizados. 6.2.2.

Esterilização por calor seco

Aquecer vidrarias, etc., em um forno de esterilização por pelo menor 1h a 170°C ou equivalente. 6.2.3.

Esterilização por calor úmido

Vapor de água sobre pressão é o melhor método de esterilização de vidrarias e materiais de laboratório. A temperatura da câmara da autoclave deve ser mantida a 121°C por no mínimo 15 min (ver 5.6.).

28

6.2.4.

Descontaminação com compostos químicos

Usar produtos químicos (e.g. produtos a base de cloro, compostos de quaternário de amônio) nas concentrações apropriadas e pelo tempo de contato adequado. Garantir que os resíduos químicos não afetarão o crescimento microbiano. 6.3.

Equipamentos e materiais descartáveis

Equipamentos e materiais descartáveis podem ser utilizados ao invés de equipamentos e materiais reutilizáveis (vidrarias, placas de Petri, pipetas, garrafas, tubos, alças, espalhadores, etc.) caso as especificações sejam similares. É aconselhável verificar se os equipamentos são apropriados para o uso em microbiologia (em particular no que diz respeito à esterilidade) e que os materiais não contenham substâncias que inibam o crescimento microbiano (ver ISO 9998). 6.4.

Armazenamento de vidrarias e materiais limpos

Proteger vidrarias e materiais limpos contra pó durante a estocagem e, em condições que mantenham a limpeza. 6.5.

Manuseio de vidrarias e materiais estéreis

Armazenar vidrarias e materiais estéreis de modo a garantir que continuem estéreis. Armazenar equipamentos de uso único de acordo com as instruções do fabricante, sem deterioração da embalagem. Armazenar limpos os equipamentos preparados. Quando da esterilização de materiais para uso microbiológico, fornecer uma data de validade para o procedimento (ou data de fabricação) em cada embalagem. 6.6.

Uso de descontaminação e desinfecção

6.6.1.

Descontaminação de equipamentos descartáveis

Descontaminar equipamentos descartáveis antes do descarte. Além dos métodos contidos neste item, a incineração pode ser utilizada. Caso haja um incinerador nas dependências, descontaminação e descarte podem ser efetuados no mesmo procedimento. 6.6.2.

Descontaminação de vidrarias e materiais antes do uso

Em geral, a esterilização de equipamentos deve ser feita por calor úmido (ver 6.2.3.) ou calor seco (ver 6.2.2.). Em certas situações (e.g. amostragem de campo), a descontaminação química pode ser necessária. Após o tratamento, o equipamento deve ser isento de substâncias inibitórias. 6.6.3.

Descontaminação de vidrarias e materiais de uso

Materiais para descontaminação e descarte devem ser colocados em recipientes, e.g. sacolas plásticas autoclaváveis. A esterilização em autoclave é o método preferível para a maioria dos processos de descontaminação (por pelo menos 30 min a 121°C). A autoclave deve ser carregada de modo a favorecer a penetração do calor, (e.g. sem sobrecarregamento) e tomando-se o cuidado de manter tampas e sacolas frouxas ou abertas. Métodos alternativos à autoclavação podem ser utilizados se a legislação nacional permitir. Autoclavar todos os equipamentos que tenham entrado em contato com culturas microbianas (meios de cultura sólidos ou líquidos), incluindo recipientes reutilizáveis antes de terem o conteúdo descartado e serem limpos.

29

Durante a análise a descontaminação por imersão de pequenos equipamentos resistentes à corrosão em desinfetantes diluídos pode ser realizada (ex. pipetas). Usar as pipetas Pasteur apenas uma única vez. A maioria dos desinfetantes (ver Anexo A) tem algum efeito tóxico. Usar luvas e protetores oculares quando da manipulação de desinfetantes concentrados. 6.7.

Manejo de descarte

O correto descarte de materiais contaminados não afeta diretamente a qualidade da análise, mas é um aspecto de boa prática de manejos laboratoriais. Este deve estar de acordo com a legislação nacional ambiental e de saúde específicas. Um sistema de identificação de separação de materiais contaminados e seus recipientes podem se estabelecidos por: -

Descarte não contaminado (e.g. amostras de alimentos não cultivados) e que possam ser descartados em lixo comum;

-

Bisturis, agulhas, facas, vidros quebrados;

-

Material contaminado para autoclavação e reutilização;

-

Material contaminado para autoclavação e descarte, ou apenas para descarte caso o material seja incinerado (ver baixo, entretanto, as exigências especiais para a categoria de risco 3 de microrganismos).

A incineração de materiais contaminados e seus recipientes deve ser realizada de acordo com a legislação nacional ambiental e de saúde específicas. Materiais contaminados com microrganismos da categoria de risco 3 e seus recipientes devem ser autoclavados antes de serem incinerados. 6.8.

Lavagem

Lavar materiais reutilizáveis apenas após a sua descontaminação. Após a lavagem enxaguar todos os equipamentos com água deionizada. Equipamentos especializados podem ser utilizados para facilitar o procedimento de limpeza (e.g. lavador de pipetas, lavadora de louças, câmara de ultrassom). Após a lavagem os materiais reutilizáveis devem estar livres de resíduos que possam afetar o crescimento microbiano. 7.

Preparação e esterilização de meios de cultura

Preparar e esterilizar os meios de cultura de acordo com a ISO/TS 11133-1 e ISO/TS 11133-2. 8.

Amostras laboratoriais

8.1.

Amostragem

8.1.1.

Geral

Embora extremamente importantes para a interpretação dos resultados a amostragem e os planos de amostragem não fazem parte deste Padrão Internacional. É importante que o laboratório receba uma amostra representativa do lote que não tenha sido danificada ou modificada durante o transporte ou armazenamento. 30

A amostra deve ser protegida de contaminação externa advinda do ar, do recipiente onde está contida, dos dispositivos de amostragem e de manipulação inadequada. Um recipiente de amostra não deve ter mais que três quartos do volume preenchido para evitar vazamentos e possibilitar a homogeneização no laboratório. Identificar as amostras clara e completamente, e registrar as informações da amostra. Frequentemente, a temperatura do momento da coleta e após a recepção da amostra mostram-se úteis para a interpretação dos resultados. A amostra deve ser entregue na embalagem original e selada. Caso o produto ou o recipiente que o contém sejam muito grandes para serem recebidos no laboratório, tomar uma amostra assepticamente e acondicionar em recipiente estéril. O recipiente estéril de amostra deve permanecer aberto apenas durante a transferência da amostra para seu interior sendo imediatamente fechado após o processo. 8.1.2.

Plano de amostragem

Amostragem não é parte deste Padrão Internacional. Ver o Padrão Internacional específico que lide com o produto em questão, se disponível. 8.2.

Transporte

O modo de transporte das amostras para o laboratório deve garantir que sejam mantidas condições que minimizem quaisquer alterações no número de microrganismos presentes. Entregar as amostras ao laboratório mantendo tanto quanto possíveis as condições originais de armazenamento. A amostra deve ser embalada de modo a evitar quebras e vazamentos. A etiqueta do produto deve indicar se é necessária refrigeração. Amostras que não necessitem refrigeração ou congelamento podem ser embaladas utilizando material apropriado para evitar danos durante o transporte. Não utilizar gelo livre uma vez que isto pode causar contaminação do produto no caso de avarias ou vazamentos no recipiente. A menos que contrariamente exigido em padrão específico (e.g. ISO 6887 e ISO 8261), as seguintes temperaturas durante o transporte são recomendadas: -

produtos estáveis: temperatura ambiente (abaixo de 40°C);

-

produtos congelados ou ultracongelados: abaixo de -15°C, preferencialmente abaixo de -18°C;

-

outros produtos não estáveis a temperatura ambiente: 1°C a 8°C;

-

amostras de esfregaços de ambiente: ver ISO 18593 e ISO 17604.

Quando nenhuma condição é especificada, recomenda-se que as partes envolvidas entrem em comum acordo quanto à temperatura e duração do transporte. 8.3.

Recepção

Verificar as condições da amostra no momento de sua recepção. No caso de condição insatisfatória ou quantidade insuficiente, o laboratório deve recusar a recepção. Em circunstâncias especiais, elas podem ser analisadas, após discussão e acordo com o cliente. 31

Entretanto, o relatório de análise deve conter ressalvas sobre a validade dos resultados. Documentar as amostras de modo que seu progresso ao longo da análise e elaboração do relatório possa ser monitorado. A identificação e codificação da amostra deve garantir a sua rastreabilidade ao longo de todas as etapas no laboratório. Se necessário, as superfícies exteriores dos recipientes podem ser desinfetadas utilizando-se desinfetantes apropriados. Analisar o recipiente de amostra em busca de defeitos físicos evidentes. Anotar as seguintes informações: -

Data (e hora, se relevante) de recepção;

Detalhes de amostragem (data e hora da amostragem, se relevantes e conhecidas, condições da amostra); -

Nome e endereço do cliente.

No momento da recepção de amostras perecíveis, registrar a temperatura de transporte ou a temperatura de uma amostra simulada incluída para esta finalidade. Analisar as amostras assim que possível após a recepção, preferencialmente dentro de 24h, ou como acordado entre as partes envolvidas. Para produtos altamente perecíveis (como mariscos), a análise deve começar dentro de 24h após a amostragem. Para produtos perecíveis (como peixe e leite cru), a análise deve ser realizada dentro de 36h. Caso o limite de tempo descrito acima não possa ser respeitado, as amostras devem ser congeladas a temperaturas inferiores a 15ºC, preferencialmente a -18ºC, uma vez que já foi demonstrado que a recuperação de microrganismos nestas condições neste tipo de matéria prima não é afetada. 8.4.

Armazenamento

Armazenar as amostras a espera de análise em condições que minimizem quaisquer alterações no número de microrganismos presentes. As seguintes temperaturas de armazenamento são recomendadas: -

Produtos estáveis: temperatura ambiente (18ºC a 27ºC);

-

Produtos congelados ou ultracongelados: abaixo de -15ºC, preferencialmente abaixo de -18ºC;

-

Outros produtos não estáveis à temperatura ambiente, incluindo alimentos estragados: 3ºC ± 2ºC (ver ISO 6887-2 a ISO 6887-4 ou ISO 8261);

-

Amostras de esfregaço de ambiente: ver ISO 18593 e ISO 17604.

8.5.

Porção teste

8.5.1.

Regras específicas para a tomada de porções teste

Consultar a parte relevante da ISO 6887, ou ISO 8261, para regras de tomada de porção teste e preparação de suspensão inicial e sua homogeneização.

32

8.5.2.

Conservação e destruição de amostras laboratoriais

Exceto em casos especiais, manter as amostras laboratoriais até que todos os resultados tenham sido obtidos, ou por mais tempo, se necessário, acondicionando-as em recipiente estéril (e.g. sacola plástica) e retornandoas a temperatura de armazenamento original. Produtos perecíveis devem ser congelados. NOTA: Não é uma pratica normalmente aceita o reteste de amostra devido à possibilidade de alteração da microbiota.

9.

Análise

9.1.

Cuidados de higiene do decorrer da análise

Para evitar a contaminação do ambiente e de amostras teste, manipular produtos em pó (desidratados) em uma área ou sala separada ou em uma cabine de proteção. Antes da abertura das amostras comuns, esfregar ao redor do ponto de pretendido de abertura uma gaze embebida em álcool 70% (por volume) ou outro produto equivalente e esperar a evaporação. Antes da abertura de embalagens estéreis, imergir a área a ser aberta em uma solução contendo 100 a 200 ppm de cloro (ou outro esterilizante adequado) por pelo menos 10 min para destruir microrganismos que possam contaminar a amostra. Quaisquer instrumentos utilizados na abertura da embalagem ou remoção de toda ou parte da amostra (abridores de lata, tesouras, colheres, pinças, pipetas, etc.) devem ser estéreis. A área de trabalho circundante deve ser limpa e desinfetada com o desinfetante apropriado antes do início das análises. As mãos devem ser lavadas imediatamente antes e durante as análises caso sejam contaminadas. Todos os equipamentos utilizados devem ser estéreis e protegidos de contaminação antes e durante o uso. Todos os equipamentos e ferramentas utilizados devem ser colocados em recipientes adequados para posteriores descarte ou esterilização. Tomar cuidados de modo a conduzir os trabalhos assepticamente. Por exemplo: a)

Assegurar-se que a área de trabalho está limpa, que todas as possíveis fontes de contaminação foram removidas ou reduzidas ao mínimo e que não haja corrente de ar (i.e. portas e janelas estejam fechadas), e evitar movimentos desnecessários de pessoas durante as análises;

b)

Antes e após o trabalho, descontaminar a superfície da área de trabalho com o desinfetante apropriado;

c)

Antes do início, garantir que tudo que for necessário para a análise encontra-se disponível;

d)

Realizar os testes sem demorar;

e)

Separar atividades “limpas” e “sujas” temporal e espacialmente (isto é particularmente importante para amostras de alto risco como carnes e ovos crus);

f)

Usar equipamentos descartáveis;

g)

Caso não seja utilizado todo o conteúdo de embalagens de pipetas e placas de Petri descartáveis, garantir que esta foi apropriadamente vedada após a remoção das unidades a serem utilizadas;

33

h)

Limpar imediatamente qualquer espirramento de amostra com algodão ou outro material embebido com 1 etanol 70% ou qualquer outro desinfetante apropriado, e então limpar e desinfetar a área de trabalho antes de continuar;

i)

Utilizar cabines de segurança quando da manipulação de produtos que possam conter bactérias patogênicas, se for especificado pela legislação nacional;

j)

Quando da retirada de pipetas dos recipientes onde ficam acondicionadas, evitar tocar a superfície externa do recipiente das demais com a ponta da pipeta, uma vez que estas são susceptíveis a contaminação;

k)

Não encostar as pipetas nas bordas ou gargalos de garrafas de diluição. Aerossóis são a maior causa de contaminação ambiental e infecções. Aerossóis podem ser formados, por exemplo: -

Quando da abertura de placas de Petri, tubos ou garrafas;

-

Quando da utilização de agitadores, seringas, centrífugas e etc.;

-

No momento do esvaziamento de pipetas;

-

No momento da esterilização de alças ou agulhas inoculadas;

-

Quando da abertura de ampolas contendo culturas congeladas e liofilizadas.

A formação destes deve ser minimizada. Para métodos moleculares, tomar cuidados adicionais de acordo com a ISO 22174. 9.2.

Preparação de suspensão inicial e diluições

9.2.1.

Geral

Preparar suspensões iniciais e diluições de acordo com as partes relevantes das ISO 6887 ou ISO 8261. O tempo decorrido entre o término da preparação da suspensão inicial e o momento em que o inóculo entra em contato com o meio de cultura não deve exceder os 45 min, a menos que seja especificado diferentemente no Padrão Internacional relevante. Os os de suspensão inicial e diluições podem ser seguidos de uma etapa de enriquecimento como descrito nos padrões específicos. 9.2.2.

Concentração

9.2.2.1. Centrifugação ou filtração em membrana Caso a enumeração de baixos números de microrganismos seja necessária, esta pode ser melhorada, quanto à precisão e sensibilidade, introduzindo-se um o de concentração de amostra. Esta concentração pode ser alcançada por centrifugação ou filtração em membrana. Quando da centrifugação, ressuspender o precipitado em um volume conhecido de diluente e proceder com as análises. Para cada combinação (alimento+microrganismo) considerada, um estudo (ver e.g. referência [23]) deve ser previamente realizado para demonstrar se a adição de um o de concentração é necessário e válido. A filtrabilidade de uma suspensão alimentícia deve ser avaliada..

1

Quando outros desinfetantes que não o etanol 70% (em volume) forem utilizados, outros tempos de contato, de acordo com as instruções do fabricante, podem ser necessário para a descontaminação.

34

O desempenho do método em geral, em termos de sensibilidade, seletividade, linearidade e repetibilidade, devem ser verificados. Caso o nível de contaminação não seja conhecido, o método padrão (sem filtração) deve ser realizado em paralelo. 9.2.2.2. Imunoseparação Caso um baixo número de microrganismos alvos esteja presente na amostra, a separação e concentração podem ser realizadas com esferas imunomagnéticas revestidas com os anticorpos apropriados. Espalhar as esferas juntamente com os microrganismos capturados, direta ou indiretamente, no meio de cultura sólido de acordo com o padrão específico. Entretanto, verificar se as esferas imunomagnéticas revestidas com o anticorpo específico utilizadas neste o de concentração são adequadas, de acordo com evidencias em estudos de avaliação publicados na literatura científica específica, preferencialmente relacionada à microbiologia de alimentos. Esta verificação é especialmente importante caso este procedimento não tenha sido validado de acordo com a ISO 16140. 10.

Enumeração

10.1.

Geral

Quando verificando a qualidade microbiológica e/ou segurança de alimentos e produtos de alimentação, normalmente não é suficiente saber quais microrganismos estão presentes. Na maioria dos casos, o aspecto quantitativo é igualmente importante, surgindo a necessidade da enumeração dos microrganismos. Isto pode ser feito de várias maneiras: via análise direta (microscopia), por inoculação de meio sólido ou líquido, com citometria, por Real-Time PCR, etc. Entretanto, este padrão Internacional apenas irá discorrer sobre a enumeração usando meios sólidos e líquidos. A enumeração em meio sólido é baseada na capacidade de muitos microrganismos de produzir colônias sobre ou dentro de meio ágar de modo a serem reconhecidas a olho nu ou com uso de lupas. Entretanto, caso a matéria prima contenha muitas partículas que possam interferir na detecção de colônias, ou se a quantidade de bactérias for muito baixa, este princípio não pode ser utilizado sem a anterior separação dos microrganismos da matéria-prima (por exemplo por filtração ou imunoseparação). Nestes casos, a enumeração em meio líquido é uma alternativa adequada. 10.2.

Enumeração usando um meio sólido

10.2.1. Geral A placa de Petri deve ser etiquetada com o número da amostra, diluição, data e quaisquer outras informações desejadas. As diluições devem ser selecionadas de modo que as placas contenham o número apropriado de colônias (ver 10.3.1.) e sobrepor qualquer propriedade inibitória. Usar uma nova pipeta estéril para a transferência de cada diluição, a menos que se trabalhe da mais diluída para a menos diluída. 10.2.2. Número de placas de Petri por diluição Para técnicas de enumeração em microbiologia de alimentos, uma placa por diluição deve ser utilizada com pelo menos duas diluições sucessivas, para laboratórios que operem com controle de qualidade de acordo com os princípios da ISO 17025. Caso apenas uma diluição seja feita ou se o laboratório não operar com controle de qualidade, então duas placas devem ser utilizadas de acordo com a ISO 8199.

35

10.2.3. Técnicas de derramamento (Pour plate) 10.2.3.1. Geral Retirar o volume necessário de diluição a ser analisado, encostando a ponta da pipeta na lateral do tubo para remover o excesso de líquido aderido ao exterior. Abrir a placa de Petri de modo a permitir a inserção da pipeta 2 e despejar o conteúdo desta. Despejar o meio ágar fundido a 44-47ºC em cada placa de Petri .Evitar adicionar o meio fundido diretamente no inóculo. Misturar imediatamente o meio fundido com o inóculo de modo a obter uma distribuição uniforme de microrganismos no meio. Esperar esfriar e solidificar deixando a placa sobre uma superfície horizontal fria (o tempo de solidificação não deve ultraar 10 min). Após a remoção do ágar fundido do banho-maria, secar a garrafa com uma toalha limpa de modo a evitar que a água contamine as placas de Petri. Evitar deixar escorrer meio por fora da garrafa ou na tampa da placa de Petri. Pode ser necessário manter a garrafa na horizontal, sem assentá-la novamente entre cada derramamento. Caso a presença de colônias que se espalhem (e.g. Proteus spp.) seja esperada no produto analisado, sobrepor as placas solidificadas com uma camada de ágar não-nutriente ou ágar idêntico ao meio utilizado no 3 teste , para evitar ou minimizar esse espalhamento. 10.2.4. Inoculação de superfície 10.2.4.1. Geral Métodos desenvolvidos para produzir crescimento de colônias apenas na superfície do ágar têm certas vantagens sobre os métodos de derramamento. A morfologia de colônias de superfície é facilmente observada, melhorando a habilidade do analista em distinguir entre diferentes tipos de colônias. Microrganismos não são expostos ao calor do ágar fundido, resultando em maiores contagens. Usar placas pré-preparadas com ao menos 3 mm de espessura de ágar que estejam sem bolhas de ar e umidade na superfície. Para facilitar o espalhamento uniforme a superfície deve ser seca de acordo com a ISO/TS 11133 ou com o especificado no Padrão Internacional relevante de modo que o inóculo seja absorvido em 15 min. 10.2.4.2. Método de espalhamento com espátula Usando uma pipeta estéril, transferir o inóculo (geralmente 0,1 ml ou 0,5 ml) de uma amostra teste líquida ou de uma suspensão inicial no caso de outras amostras para uma placa de ágar (de 90 a 140 mm de diâmetro, respectivamente). Repetir este o para a próxima diluição decimal (as colônias a serem contadas estão -1 -2 presentes na diluição 10 no caso de amostras líquidas de material e 10 no caso de outros materiais) e, se necessário, repetir para as diluições decimais subsequentes. Caso necessária a detecção de baixas cargas microbianas no caso de certos produtos, o limite de detecção pode ser aumentado na ordem de 10 vezes analisando-se 1,0 ml de amostra no caso de produtos líquidos e 1,0 ml de suspensão inicial no caso de outros produtos. Para esta finalidade, 1,0 ml de inóculo é espalhado sobre a superfície de uma placa de Petri grande (140 mm de diâmetro) ou sobre a superfície de três pequenas placas de Petri (90 mm de diâmetro). Usando uma espátula de espalhamento feita de vidro, plástico ou metal (por exemplo feita de vidro e com formato de bastão de hockey de cerca de 3,5 mm de diâmetro e 20 cm de comprimento, dobrada em ângulos retos a cerca de 3 cm de uma extremidade e achatadas nas pontas por aquecimento), espalhar o inóculo o

2 3

Geralmente 18 a 20 ml de ágar em 90 ml de placas de Petri, para obter ao menos 3 mm de espessura. Geralmente 5 ml de ágar em placas de Petri de 90 mm.

36

mais rápido possível uniformemente sobre o ágar sem tocar as bordas da placa de Petri. Esperar o ágar absorver o inóculo com as placas tampadas por cerca de 15 min a temperatura ambiente. Em certos casos (como descrito no Padrão Internacional relevante), O inóculo pode ser depositado sobre uma membrana e depois ser espalhado como descrito anteriormente. 10.2.4.3. Método de plaqueamento helicoidal 10.2.4.3.1. Geral O método de plaqueamento helicoidal para determinação da carga microbiana foi testado em testes interlaboratoriais com leite e derivados e para outros produtos. O equipamento utilizado – um semeador helicoidal – está descrito no item 5.24. 10.2.4.3.2. Preparação das placas de ágar Um dispensador automático com um sistema de distribuição é recomendado para a preparação de placas de ágar, para garantir que elas estejam niveladas. Colocar a mesma quantidade de ágar em todas as placas de modo que a mesma altura de ágar esteja presente em todas as placas submetidas ao bico dosador do semeador helicoidal mantendo o ângulo de contato correto. Alternativamente, placas preparadas e disponíveis comercialmente podem ser utilizadas. 10.2.4.3.3. Procedimentos de plaqueamento e contagem Descontaminar a ponteira e os tubos por imersão em solução de hipoclorito de sódio (ver 5.24.4) e então enxaguar o sistema com água estéril antes do uso. Colocar uma placa de Petri com ágar na mesa giratória e baixar a ponteira. A amostra é diferencialmente distribuída com o subir da ponteira e girar da placa. Retirar a placa inoculada e retornar a ponteira para a posição inicial. Descontaminar a ponteira e carregar o inóculo para outra placa. Após a incubação, colocar a grade de contagem em espiral centralizada na placa. Usar a régua de contagem 20 para determinar a contagem. Escolher uma região e começar a contagem de fora para dentro do primeiro segmento até atingir 20 colônias. Completar a contagem das colônias remanescente deste segmento. Contar uma área correspondente do outro lado da placa e dividir o número de colônias contadas em ambos os lados pelo volume depositado nestas áreas. Os volumes de amostra associados com cada porção da grade de contagem são fornecidos no manual de instruções que acompanha o equipamento. 10.2.5. Incubação A menos que determinado o contrário em padrão específico, inverter as placas imediatamente após a inoculação, e colocá-las rapidamente em, uma estufa ajustada para a temperatura adequada. Caso ocorra desidratação excessiva (e.g. a 55ºC ou em forte circulação de ar), embalar frouxamente as placas em sacolas antes da incubação ou usar sistema de eficiência similar. Durante o período de incubação, variações menores na temperatura de incubação podem ser inevitáveis e aceitáveis, por exemplo, durante o preenchimento ou esvaziamento das estufas, mas é importante que estes períodos sejam s. A duração destas variações deve ser monitorada para garantir que elas não surtem efeitos nos resultados. NOTA: Em certos casos, pode ser útil manter placas inoculadas a 3ºC ± 2ºC para serem usadas em comparação com as inoculadas e incubadas; isto durante a contagem pode evitar a confusão de partículas de produto com colônias. Uma lupa binocular de aumento também pode ser utilizada para distinguir partículas de produto de colônias.

37

Em certas circunstâncias, pode ser desejável para a organização do trabalho no laboratório refrigerar as placas inoculadas por no máximo 24h antes da incubação. Caso isto seja feito, o laboratório deve garantir que esta prática não afeta o resultado de contagem. Geralmente, placas de Petri não devem ser empilhadas em mais de 6 unidades para incubação anaeróbica e devem ser separadas umas das outras e das paredes da estufa por no mínimo 25 mm. Entretanto, empilhamentos maiores com menores espaçamentos são aceitáveis em estufas equipadas com sistemas de circulação de ar; neste caso, a distribuição da temperatura deve ser verificada. Após a incubação, as placas devem ser imediatamente analisadas. Elas podem, entretanto, ser armazenadas, exceto se o contrário seja determinado em padrão específico, por até 48h em refrigerador. Armazenamentos por períodos de tempo maiores são aceitáveis apenas tiver sido mostrado que isto não afeta o número, a aparência e subsequente confirmação de colônias. Para certos meios que contém corantes indicadores, as placas refrigeradas devem ser mantidas a temperatura ambiente até o equilíbrio antes da análise, para garantir que a correta coloração tenha retornado. 10.3.

Cálculo e descrição dos resultados obtidos em meio sólido

10.3.1. Contagem de colônias Após o período de incubação estabelecido no padrão específico, contar as colônias (colônias totais, típicas ou presumidas) para cada placa de Petri contendo menos que 300 colônias (ou qualquer outro número estabelecido no padrão específico). Quando da contagem de colônias típicas ou presumidas, a descrição das colônias deve ser como a fornecida no padrão específico. Em certos casos pode ser difícil contar as colônias (quando, por exemplo, microrganismos que se espalham estão presentes). Considerar colônias espalhadas como únicas. Caso menos de um quarto da placa apresente supercrescimento por espalhamento, contar as colônias da parte não afetada da placa e calcular a partir dela o número total de colônias na placa. Deduzir por extrapolação o número teórico que deve corresponder à placa inteira. Caso mais de um quarto da placa apresente supercrescimento, descartá-la. Considerar colônias espalhadas em cadeia como única colônia. Nos vários métodos de cálculo mostrados em 10.3.2., devem ser consideradas placas sem colônias, quando estas forem mantidas. Quando um semeador helicoidal for utilizado, a contagem de colônias será como descrito em 10.2.4.3.3. 10.3.2. Descrição dos resultados 10.3.2.1. Geral 10.3.2.1.1. Casos incluídos neste subitem são casos gerais: -

inoculação de uma placa de Petri de 90 mm por diluição;

-

número máximo de colônias para o total de colônias presentes: 300 por placa;

-

número máximo total de colônias (típicas e atípicas) presentes na placa quando da contagem de colônias típicas ou presuntivas: preferencialmente 300 por placa;

-

número máximo de contagem de colônias típicas ou presuntivas: 150 por placa;

-

número de colônias típicas ou presuntivas inoculadas para identificação ou confirmação (ver 10.3.2.3.) em cada placa considerada: em geral 5.

Estas situações são definidas em padrões específicos. 38

Quando placas com diâmetro diferente de 90 mm são utilizadas, o número de colônias deve ser aumentado ou diminuído na proporção da área de superfície das placas (ou membranas). 10.3.2.1.2. Os métodos de cálculo fornecidos abaixo são para casos que ocorrem mais frequentemente quando os testes são realizados de acordo com as boas práticas laboratoriais. Casos especiais podem eventualmente ocorrer (por exemplo, a razão de diluição de duas diluições sucessivas serem muito diferentes), então os resultados de contagem obtidos devem ser analisados por um microbiologista qualificado e, se necessário, rejeitados. 10.3.2.2. Métodos de cálculo: casos gerais (contagem total de colônias ou de colônias típicas) Para um resultado ser válido, é necessário contar as colônias em pelo menos uma placa contendo mais de 10 colônias [total de colônias, colônias típicas ou colônias de acordo com os critérios de identificação (ver 10.3.2.3.)]. Calcular o número N de microrganismos presente na amostra teste como uma média ponderada de duas sucessivas diluições usando a equação (1): ∑

(1)

Onde: ∑C é a soma das colônias contadas nas duas placas selecionadas de duas diluições consecutivas, com ao menos uma contendo um mínimo de 10 colônias; V

é o volume de inóculo em cada placa, em mililitros;

d

é a diluição correspondente à primeira diluição selecionada [d =1 quando o produto líquido não diluído é selecionado (amostra teste)].

Arredondar os valores calculados para dois algarismos significativos. Sendo assim, caso o terceiro algarismo seja menor que 5, não modificar a algarismo anterior, mas caso este seja maior que 5, aumentar o algarismo anterior em uma unidade. Descrever o resultado preferencialmente como um número entre 1,0 e 9,9 multiplicado pela potência de 10 apropriada, ou como um número completo com dois algarismos significativos. Descrever os resultados como o número N de microrganismos por mililitro (produtos líquidos) ou por grama (outros produtos). EXEMPLO: A contagem produziu os seguintes resultados: -2

-

Na primeira diluição selecionada (10 ): 168 colônias;

-

Na segunda diluição selecionada (10 ): 14 colônias.

-3

∑ 4

Arredondando o resultado acima, o número de microrganismos é 17.000 ou 1,7 x 10 por mililitro ou por grama de produto. 10.3.2.3. Método de cálculo: após a identificação Quando o método utilizado faz uso de identificação, um dado número A (geralmente 5) de colônias presumidas é identificados de cada placa selecionada para contagem. Após a identificação, calcular para cada placa, o número a de colônias que atendam ao critério de identificação, usando a equação (2):

39

(2) Onde: b

é o número de colônias que atendem aos critérios de identificação dentre as colônias identificadas A;

C

é o número total de colônias presumidas contadas na placa.

Arredondar os valores calculados para dois algarismos de significativos. Sendo assim, caso o terceiro algarismo seja menor que 5, não modificar a algarismo anterior, mas caso este seja maior que 5, aumentar o algarismo anterior em uma unidade. Calcular o valor N de microrganismos presentes na amostra teste substituindo ∑C por ∑a na equação fornecida em 10.3.2.2. Arredondar os resultados como especificado em 10.3.2.2. Descrever os resultados como especificado em 10.3.2.2. EXEMPLO: A contagem forneceu os seguintes resultados: -3

-

Na primeira diluição selecionada (10 ): 66 colônias;

-

Na segunda diluição selecionada (10 ): 4 colônias.

-4

O teste das colônias selecionadas apresentou os seguintes resultados: -

Das 66 colônias, 8 foram testadas, 6 das quais se apresentaram dentro dos critérios de identificação, então a = 50;

-

Das 4 colônias, todas as 4 apresentaram-se dentro dos critérios de identificação, então a = 4; ∑

Arredondando o resultado como especificado em 10.3.2.2., o número de microrganismos é 49.000 ou 4,9 x 10 por mililitro ou por grama de produto.

4

10.3.2.4. Método de cálculo: Baixas contagens 10.3.2.4.1. Caso em que uma placa contém menos de 10 colônias (de amostra teste ou suspensão inicial ou primeira diluição) Contagens de 10 até o limite possível (prático) de colônias de cada método são o intervalo de precisão excelente. A precisão cai rapidamente à medida que as contagens de colônias ficam abaixo das 10 colônias por placa. Dependendo do propósito do teste, limites inferiores de determinação podem ser estabelecidos como descrito abaixo para contagens inferiores a 10. De acordo com a ISO/TR 13843, a definição de limite de determinação é: “Menor concentração média de partículas x por porção analítica na qual a incerteza relativa padrão iguala-se a um valor especificado (RSD)”. O RSD é o desvio padrão relativo, que é calculado pela divisão do desvio padrão estimado s para uma população de uma amostra pela média ̅ desta amostra. Ao invés de RSD, o símbolo w será utilizado para o desvio padrão relativo. Então, ⁄ ̅. No caso de uma distribuição de Poisson, x é calculado pela equação: ( )

(3)

40

Se w é fixado em 50% como limite de precisão relativa aceitável (que parece razoável em microbiologia), o menor limite de determinação será fornecido pelo número de colônias (

)

Portanto, resultados baseados em contagens menores que 4 devem ser considerados apenas como indicadores qualitativos de presença. Resumindo: Se uma placa contém menos de 10 colônias, mas ao menos 4 colônias, calcular o resultado como caso geral (10.3.2.2.), e descrever os resultados como número estimado x de microrganismos por mililitro (produtos líquidos) ou por grama (outros produtos). Caso o total seja entre 1 e 3, a precisão dos resultados é baixa demais e o resultado deve ser descrito como: “Microrganismos estão presentes mas em quantidades menores que (4 x d) por grama ou ml” 10.3.2.4.2 Caso em que uma placa não contém colônias (amostra teste ou suspensão inicial ou primeira diluição) Caso as placas de amostra teste (produtos líquidos) ou suspensão inicial (outros produtos) ou a primeira diluição inoculada não contiverem colônias, descrever o resultado como a seguir: “Menos de 1/d microrganismos por mililitro” (produtos líquidos) ou “menos de 1/d microrganismos por grama” (outros produtos). 0

Onde d é o fator de diluição da suspensão inicial ou da primeira diluição inoculada (d = 10 = 1 quando a amostra teste for diretamente inoculada e cuja placa for selecionada). 10.3.2.4.3. Casos especiais 10.3.2.4.3.1. Geral Estes casos dizem respeito à contagem de colônias típicas ou presuntivas. 10.3.2.4.3.2. Caso 1 Se o número de colônias típicas e atípicas da placa contendo a diluição d1 é maior que 300 (ou qualquer outro número estabelecido no padrão específico), com colônias típicas visíveis ou colônias confirmadas, e se a placa contendo a diluição subsequente d2 contém menos de 300 colônias (ou qualquer outro número estabelecido no padrão específico), e nenhuma colônia típica ou confirmada visível, descrever os resultados como: “Menos de 1/d2 e mais que 1/d1 microrganismos por mililitro” (produtos líquidos) ou “menos de 1/d2 e mais que 1/d1 microrganismos por grama” (outros produtos). Onde d1 e d2 são fatores de diluição correspondentes à diluição d1 e d2. EXEMPLO: A contagem forneceu os seguintes resultados: -2

A primeira diluição selecionada (10 ): mais de 100 colônias na placa, com típicas ou confirmadas presentes; -

-3

A segunda diluição selecionada (10 ): 33 colônias, sem colônias típicas ou confirmadas presentes.

O resultado, expresso em microrganismos, é menos de 1.000 e mais de 100 por mililitro ou por grama de produto.

41

10.3.2.4.3.3. Caso 2 Se o número de colônias típicas e atípicas da placa contendo a diluição d1 é maior que 300 (ou qualquer outro número estabelecido no padrão específico), sem colônias típicas visíveis ou colônias confirmadas, e se a placa contendo a diluição subsequente d2 contém menos de 300 colônias (ou qualquer outro número estabelecido no padrão específico), e nenhuma colônia típica ou confirmada visível, descrever os resultados como: “Menos de 1/d2 microrganismos por mililitro” (produtos líquidos) ou “menos de 1/d2 microrganismos por grama” (outros produtos). Onde d2 é o fator de diluição correspondente à diluição d2. EXEMPLO: A contagem forneceu os seguintes resultados: -2

A primeira diluição selecionada (10 ): mais de 100 colônias na placa, sem típicas ou confirmadas presentes; -

-3

A segunda diluição selecionada (10 ): 33 colônias, sem colônias típicas ou confirmadas presentes.

O resultado, expresso em microrganismos, é menos de 1.000 por mililitro ou por grama de produto. 10.3.2.5. Método de cálculo: casos especiais 10.3.2.5.1. Quando o número de colónias contadas (colônias totais, típicas ou presuntivas) é maior que 300 (ou qualquer outro número estabelecido no padrão específico) na placa da primeira diluição d1, com um número de colônias (colônias totais, típicas ou que atendam aos critérios de identificação) menor que 10 por placa contendo a diluição subsequente d2: -

Caso o número de colônias da placa contendo a diluição d1 esteja entre o intervalo de 300 e 334 (a parte superior do limite de confiança para uma média ponderada igual a 300), usar o método de cálculo para casos gerais (ver 10.3.2.2.);

-

Caso o número de colônias da placa contendo a diluição d1 seja maior que 334 (limite superior do intervalo de confiança para uma média ponderada igual a 300), levar em consideração apenas a contagem da diluição d2 e calcular uma contagem estimada (ver 10.3.2.4.), exceto quando um máximo de 300 colônias foi estipulado para a contagem de colônias, se esta estimativa for menor que 8 (limite inferior do intervalo de confiança para uma média ponderada igual a 10), uma vez que a diferença entre as duas diluições é inaceitável.

Os algarismos correspondentes aos intervalos de confiança devem ser adaptados ao número máximo estabelecido na contagem de colônias. EXEMPLO 1 – A contagem forneceu os seguintes resultados: -2

-

A primeira diluição selecionada (10 ): 310 colônias;

-

A segunda diluição selecionada (10 ): 8 colônias.

-3

Usar o método de cálculo para casos gerais usando placas para as duas diluições selecionadas. EXEMPLO 2 – A contagem forneceu os seguintes resultados: -2

-

A primeira diluição selecionada (10 ): mais de 334 colônias;

-


-3

-3

Relatar uma contagem estimada com base nas colônias contadas na placa da diluição 10 . EXEMPLO 3 – A contagem (quando um máximo de 300 colônias foi estabelecido para a contagem) forneceu os seguintes resultados: -

-2

A primeira diluição selecionada (10 ): mais de 334 colônias; 42

-

-3


O resultado desta contagem é inaceitável. EXEMPLO 4 – A contagem (quando um máximo de 150 colônias foi estabelecido para a contagem) forneceu os seguintes resultados: -2

-

A primeira diluição selecionada (10 ): mais de 167 colônias na placa (limite superior de confiança com média ponderada igual a 150);

-


-3

-3

Relatar uma contagem estimada com base nas colônias contadas na placa da diluição 10 . 10.3.2.5.2. Quando o número de colónias contadas (colônias totais, típicas ou presumidas) para cada uma das placas de todas as diluições inoculadas produz um número maior que 300 (ou qualquer outro número estabelecido no padrão específico), descrever o resultado como a seguir: “mais de 300/d” (no caso de total de colônias ou colônias típicas) ou “mais que 300 x b/A x 1/d” (no caso de colônias confirmadas), expressos em microrganismos por mililitro (produtos líquidos) ou microrganismos por grama (outros produtos). Onde: d

é a diluição da última diluição inoculada;

b

é o número de colônias que atendem aos critérios de identificação dentre as presuntivas A.

10.3.2.5.3. Quando a placa com a última diluição inoculada contém mais que 10 colônias e menos que 300 (ou qualquer outro número estabelecido no padrão específico), colônias (colônias totais, típicas ou presumidas), calcular o número N’ de microrganismos presentes usando a equação (4):

Onde c

é o número de colônias contadas na placa;

V

é o volume do inóculo usado em cada placa, em mililitros;

d

é a diluição correspondente à selecionada.

Arredondar os valores como especificado em 10.3.2.2. Descrever os resultados como número N’ de microrganismos por mililitro (produtos líquidos) ou por grama (outros produtos) EXEMPLO – A contagem forneceu os seguintes resultados: -

-4

A última diluição selecionada (10 ): 120 colônias.

Portanto, Arredondando o resultado como especificado em 10.3.2.2., o número N’ de microrganismos é 1.200.000, ou 1,2 6 x 10 por mililitro ou por grama de produto. 10.3.2.6. Medição da incerteza Ver ISO/TS 19036 para determinações quantitativas. 10.4.

Enumeração de bolores e leveduras 43

10.4.1. Geral Bolores e leveduras podem ser enumerados via técnica de derramamento, que permite uma enumeração mais fácil, ou por espalhamento na superfície de ágar, que possibilita a maior exposição possível ao oxigênio atmosférico e evita o estresse térmico do ágar fundido. Placas preparadas devem ser secas antes de inoculadas (ver ISO/TS 11133). Alguns bolores e leveduras podem ser infeciosos ou provocar respostas alérgicas, em alguns casos até mesmo em indivíduos saudáveis. Portanto, é importante tomar bastante cuidado quando se lida com estes microrganismos. Idealmente as placas devem ser mantidas em estufas, não em salas abertas. As tampas devem ser removidas apenas quando inevitável, apenas por razões essenciais como a preparação de lâminas de microscopia. Agulhas flambadas devem ser resfriadas antes de efetuar a transferência, para evitar a dispersão de conídios e outras células. Bancadas e estufas devem ser desinfetadas frequentemente. As placas de Petri devem ser incubadas sem ser invertidas e deixadas paradas até o momento da contagem, uma vez que movimentos podem causar liberação de conídios e desenvolver colônias satélites, fornecendo uma superestimativa da população. 10.4.2. Contagem de colônias de fungos e leveduras Placas com 10 a 150 colônias são normalmente contadas. Caso a microbiota consista primariamente de bolores, selecionar placas que contendo as menores contagens; caso a microbiota consista primariamente de leveduras, selecionar placas que contendo contagem abaixo do limite superior de confiança. Caso a identidade das colônias seja duvidosa, examinar bolores úmidos ou linhagens de células de ao menos 5 colônias por amostra para confirmar que bactérias não estão presentes. 10.5.

Enumeração usando meio líquido

10.5.1. Princípio As porções teste são inoculadas em meio líquido que é desenvolvido para permitir o crescimento de um microrganismo em particular ou um grupo de microrganismos, e frequentemente iniba a proliferação de microrganismos não desejados. Para determinar se o crescimento do microrganismo alvo ocorreu, vários critérios podem ser utilizados, e.g. detecção visual de turbidez, produção de gás, mudanças de coloração, subsequente isolamento de microrganismos em meio ágar seletivo. A composição do meio de cultura e o critério de discriminação entre resultados positivos e negativos são definidos pelos padrões específicos correspondentes. Usando esta abordagem apenas um valor qualitativo pode ser atribuído para cada porção teste, i.e. o resultado é positivo ou negativo. Para obter uma estimativa da quantidade de microrganismos que estão presentes é necessário analisar muitas porções teste e usar procedimentos estatísticos para determinar o número mais provável (NMP). 10.5.2. Inoculação 10.5.2.1. Geral Se um meio de crescimento seletivo é utilizado, a adição da porção teste não deve reduzir estas propriedades seletivas (o que culminaria com o crescimento de microrganismos não desejados). Na maioria dos padrões, informações sobre compatibilidade da matéria-prima e o meio líquido utilizado são descritas no âmbito de aplicação, mas cuidados devem ser tomados com produtos como pimentas, cacau, sopas, etc. uma vez que eles podem conter substâncias inibitórias que necessitam da adição de compostos neutralizantes, uso de fatores de diluição maiores, centrifugação, filtração ou separação imunomagnética para separar os microrganismos da matéria-prima, mesmo que isto não seja especificado nos padrões correspondentes. Incompatibilidade pode também ser devido à natureza da matéria-prima: amostras ambientais altamente 44

contaminadas, produtos fermentados e produtos com bactérias probióticas representam desafios maiores aos microbiologistas que amostras com baixas cargas microbianas. Para estas matrizes problemáticas, experimentos usando microrganismos representativos devem ser realizados para verificar se o método é compatível com a matriz. 10.5.2.2. Procedimentos A menos que contrariamente determinado nos padrões correspondentes, porções teste de volumes menores ou iguais a 1 ml são normalmente adicionados a cinco a dez vezes de volume de meio de concentração simples. Porções teste entre 1 ml e 100 ml são normalmente adicionados em volumes iguais de meio de dupla concentração. Para volumes maiores que 100 ml, meios mais concentrados devem ser utilizados. Para propósitos especiais, meio desidratado estéril pode ser dissolvido em amostra resfriada (ou pré-aquecida a 30°C) a ser analisada. A menos que disposto o contrário, o tempo entre a preparação da primeira diluição e a inoculação do último tubo, placa de múltiplos poços ou garrafa deve ser menor que 15 min. Uma nova pipeta estéril deve ser utilizada a cada diluição. 10.5.3. Escolha do sistema de inoculação A essência do método do NMP é a diluição da amostra de modo que os inóculos conterão algumas vezes, mas não sempre, microrganismos viáveis. O produto, i.e. o número de inóculos que produzem crescimento em cada diluição fornecerá uma estimativa da concentração inicial da bactéria na amostra. Para obter estimativas em intervalos grandes de possíveis concentrações, os microbiologistas utilizam diluições seriadas, incubando muitos tubos (ou placas, etc.) a cada diluição. O número mais provável (NMP) de microrganismos presentes na amostra original, e a precisão de estimativa, podem ser calculados por procedimentos estatísticos com base em números de tubos positivos e negativos observados após a incubação. Escolher um das várias configurações de NMP de acordo com: -

o número esperado de microrganismos na amostra em análise;

-

exigências regulamentais;

-

a precisão necessária, e

-

quaisquer outras considerações de ordem prática.

A medida da incerteza depende, a grosso modo, do número de porções teste positivas observadas como a medida de incerteza da contagem de colônias depende do número de colônias em placa. A medida da incerteza aumenta com a raiz quadrada do número de tubos utilizados. O número de tubos tem que ser quadruplicado para reduzir a incerteza pela metade. Quando sistemas tem baixo número de tubos, a medida da incerteza é baixa. Dependendo do tamanho, porções teste podem ser inoculadas em tubos ou garrafas contendo o meio líquido necessário. Para pequenas porções, placas de múltiplos poços podem ser utilizadas. 10.5.3.1. Sistema de diluição única Quando a concentração de microrganismo esperada é pequena ou a variabilidade desta é moderada, o sistema de inoculação mais apropriado é o de séries únicas de porções testes iguais. Quando a razão entre o máximo e mínimo número de microrganismos esperados é de cerca de 25, dez porções teste paralelas é o menor número a ser utilizado funcionalmente; com 50 tubos paralelos, uma razão de 200 é o limite. Exemplos de diluições únicas para NMPs são fornecidos no Anexo B, Tabelas B.1 a B.4. 10.5.3.2. Sistema de múltiplas diluições Quando a concentração de microrganismo esperada é desconhecida ou espera-se uma grande variação nesta, pode ser necessária a inoculação de um sistema com muitas séries de diluições. Inocular um número suficiente 45

de tubos para fornecer resultados positivos e negativos. O número de diluições também depende do método de cálculo de NMP utilizado. Caso precise utilizar tabelas, os resultados destas diluições devem estar disponíveis e a configuração do sistema aqueles disponíveis nas tabelas. Com programas computacionais, os números de diluições e tubos paralelos são irs. 10.5.3.3. Sistemas simétrico de diluições O mais comum sistema simétrico de diluições para NMP utilizado faz uso de três ou cinco tubos em paralelo por diluição. A precisão obtida com este sistema cai rapidamente com a diminuição do número de tubos por diluição. Resultados de um sistema de três tubos são quase que não mais que indicadores da ordem de grandeza da concentração de microrganismos. Caso uma maior precisão seja necessária, recomenda-se que cinco ou mais tubos em paralelo sejam utilizados. Exemplos de NMP com três e cinco tubos são fornecidos no Anexo B, Tabelas B.5 e B.7, respectivamente. 10.5.3.4. Sistemas não simétricos de diluições Em sistemas não simétricos, os diferentes níveis de diluição não possuem o mesmo número de tubos. Usar este sistema apenas para estimar número de microrganismos dentro de um intervalo bem definido de concentrações possíveis. Para exemplo, consultar a ISO 8199. 10.5.4. Incubação Incubar os tubos, frascos e garrafas inoculadas em uma estufa ou banho-maria. Colocar placas de múltiplos poços em estufa. Escolher a duração e temperatura de incubação após consultar o método em padrão específico, uma vez que este binômio depende do microrganismo ou grupo de microrganismos analisados. Para alguns microrganismos, um procedimento de incubação de duas etapas e/ou um o confirmatório podem ser necessários. Consultar o padrão específico para detalhes. 10.5.5. Interpretação dos resultados Os critérios que distinguem resultados positivos de negativos variam de acordo com o microrganismo ou grupo de microrganismos e são definidos nos padrões correspondentes. Usando estes critérios contar e registrar o número de resultados positivos obtidos com todas as porções teste advindas de uma amostra. 10.5.6. Determinação dos valores de NMP Há três diferentes possibilidades para determinar o valor de NMP: cálculo com fórmula matemática, consulta de tabelas de NMP ou utilização de programas de computador específicos. Uma vez que estes são baseados nas mesmas considerações estatísticas, eles são igualmente válidos. Estes três métodos são detalhados abaixo. 10.5.6.1. Fórmulas matemáticas O valor aproximado NMP para quaisquer números de diluição e tubos em paralelo são derivados da aplicação da seguinte equação (adaptada da referência [36]):

√ Onde: Zp

é o número de tubos positivos;

mr

é a massa da amostra de referência, em gramas; 46

ms

é a massa total, em gramas, da amostra em todos os tubos com reações negativas;

mt

é a massa total, em gramas, da amostra em todos os tubos.

O NMP é expresso por massa da amostra de referência em gramas (geralmente 1g, algumas vezes 100g). 10.5.6.1.2. Solução “exata” para séries únicas de tubos O valor NMP para séries únicas de tubos é derivado da fórmula:

[

]

Onde: mr

é a massa da amostra de referência, em gramas;

ms

é a massa da amostra, em gramas, em cada tubo da série;

ln

é o logaritmo natural

n

é o número de tubos na série;

zp

é o número de tubos com reação positiva.

10.5.6.1.3. Estimativas de precisão para ensaios de diluição única O limite de confiança de 95% da estimativa do NMP pode ser calculado aproximadamente com a equação:

[

√ (

)

]

Onde: x

é o limite superior ou inferior de 95% de confiança;

mr

é a massa da amostra de referência, em gramas;

mm

é a massa da amostra, em gramas, em cada tubo da série;

ln

é o logaritmo natural

n

é o número de tubos na série;

zn

é o número de tubos com reação negativa.

O sinal de positivo é referente ao limite inferior e o sinal negativo é referente ao limite superior de confiança. A aproximação não é muito boa quando a maior parte dos tubos é negativa, mas aumenta conforme aumenta a proporção de tubos positivos. 10.5.6.1.4. Estimativas de precisão para ensaios de múltiplas diluições simétricas O log10 da incerteza padrão do sistema de NMP de múltiplas diluições pode ser obtido da equação aproximada [28] de Cochran : 47

√ Onde: SE

é o erro padrão do log10NMP; é o fator de diluição entre diluições consecutivas (principalmente 10);

n

é o número de tubos por diluição.

Os limites superior e inferior de 95% de confiança podem ser aproximados respectivamente pela multiplicação e divisão do NMP estimado pelo antilogaritmo de 2 x SE. Este procedimento tende a exagerar o limite superior de confiança. 10.5.6.2. Tabelas de NMP 10.5.5.2.1. Tabelas para sistemas de diluições únicas As tabelas B.1. a B.4 (Anexo B) apresentam valores de NMP e de intervalos de confiança de 95% por porção teste para 10, 15, 20 e 25 tubos paralelos cada tubo é inoculado com a mesma diluição (única)]. Para expressar os resultados por massa de amostra de referência (ou volume para amostras líquidas), multiplicar o NMP e os valores limites de 95% pela razão (massa de referência)/(massa da porção teste). Não multiplicar a incerteza padrão logarítmica. A massa de referência em microbiologia de alimentos é normalmente 1 g. A massa de porção teste corresponde à quantidade de amostra (em gramas) que está presente em um -1 volume usado para inocular os tubos, e.g. 0,1 g se foi utilizado 1 ml de homogeneizado a 10 . EXEMPLO (Referência [30]) Vinte tubos com caldo de concentração dupla foram inoculados com alíquotas de 5 ml de amostra diluída dez vezes (0,1 g/ml). Após a incubação, 16 dos tubos apresentaram crescimento visível. Qual foi a densidade bacteriana mais provável (organismos por grama) na amostra? A Tabela B.3 apresenta 1,61 como o número mais provável de microrganismos por tubo, com o limite inferior de 0,93 e superior de 2,77 com a confiança de 95%. Cada tubo recebeu uma porção teste de 5 ml, que corresponde a 0,5 g de amostra. Então, o número mais provável de microrganismos em 1 g de amostra é dado por: por grama = 3,2 por grama Com o intervalo de confiança de 95% variando de:

10.5.6.2.2. Tabelas para sistemas de múltiplas diluições: três diluições sucessivas Com sistemas simétricos, é uma prática comum utilizar três diluições sucessivas com réplicas de três tubos (Tabela B.5.) ou cinco tubos (Tabela B.7.) cada uma. Registrar o número de resultados positivos para cada grupo de tubos e, a partir da tabela de NMP para o sistema utilizado, ler o número mais provável de microrganismos presentes no volume de referência da amostra.

48

Algumas combinações de tubos positivos são mais comuns de ocorrer que outras. Por exemplo, a combinação de resultados positivos 0, 0, 3 é muito menos comum de ocorrer que a 3, 2, 1. Para quantificar esta probabilidade, foi atribuída uma categoria a todos as combinações possíveis de resultados positivos, variando de 0 a 3. A categoria 1 de resultado é um resultado com maior probabilidade, enquanto a categoria 3 de resultado é rara e pode ser de difícil reprodução. Os piores casos são os da categoria 0 de resultados; eles devem ser considerados suspeitos. Assumindo que os resultados de análise estejam corretos, seria de se esperar que 95% dos resultados fossem incluídos na categoria 1, 4% na categoria 2, 0,9% na categoria 3 e apenas 0,1% na categoria 0. As categorias são posteriormente explicadas na Tabela B.6. Nos casos em que mais de 3 diluições são feitas, a seleção da combinação correta de 3 diluições consecutivas não é sempre muito clara. Entretanto, isto pode ser facilmente feito registrando-se todas as possíveis combinações de tubos positivos e lendo a categoria correspondente na Tabela B.5. Então, aplicar as seguintes regras: 1) Selecionar a combinação de três diluições consecutivas tendo o perfil de categoria 1 para obter o índice NMP. Caso mais de uma combinação pertencente à categoria 1 seja obtido, usar o que possui o maior número de tubos positivos. 2) Caso não haja combinações pertencentes à categoria 1, usar uma tendo o perfil de categoria 2. Caso mais de uma combinação pertencente à categoria 2 seja obtido, usar o que possui o maior número de tubos positivos. 3) Caso não haja combinações pertencentes à categoria 2, usar uma tendo o perfil de categoria 3. Caso mais de uma combinação pertencente à categoria 3 seja obtido, usar o que possui o maior número de tubos positivos. Alguns exemplos são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1 – Exemplos de seleção de resultados positivos para cálculo de NMP Amostra

b

NMPb Produto líquido (ml-1)

Outros produtos (g-1)

1,1 x 101

1,1 x 102

2,4 x 101

2,4 x 102 7,4 x 101

Produto líquido:

10 ml

1 ml

10-1 ml

10-2 ml

10-3 ml

Outros produtos:

1g

10-1 g

10-2 g

10-3 g

10-4 g

1

3

3

2

1

0

2

3

3

3

0

3

2

2

1

1

0

7,4

4

3

3

0

0

0

2,4

5 a

Número de tubos positivos obtidos em três tubos incubados para as seguintes quantidades de amostra inoculada por tubo a

2

2

0

1

0

2,1 x 10

2,4 x 101 -1

2,1

Sublinhados indicam as combinações selecionadas Calculado usando o índice NMP (ver Tabela B.5.)

10.5.6.3. Programas de computador Os programas mais versáteis de computador não aplicam restrições referentes a número de diluições e tubos paralelos ou simetria dos sistemas NMP. NPM Assay Analyzer é um programa disponível baseado em programas prévios (ver Referência [29]). 10.5.7. Descrição dos resultados

49

A partir do índice NMP mostrado na tabela B.5. [de acordo com a combinação de três (ou cinco) diluições consecutivas selecionadas], determinar o número mais provável de microrganismos em um volume de referência. Relatar os resultados como número mais provável de microrganismos (ou grupo específico de microrganismos) por grama ou mililitro. A massa ou volume de referência pode ser diferente de g ou ml (por exemplo 100 g ou 100 ml). 11.

Método de detecção (método qualitativo)

11.1.

Geral

O método de detecção é um método que determina a presença ou ausência de um microrganismo em particular em uma dada quantidade de produto.

11.2.

Princípio

A menos que o contrário seja determinado em Padrão Internacional específico, misturar (produtos líquidos) ou homogeneizar (outros produtos) uma quantidade P de produto a ser analisado em 9 x P ml ou 9 x P g de um caldo seletivo e/ou eletivo. Para facilitar a recuperação de microrganismos estressados em alimentos, amostras são normalmente préenriquecidas em caldo seletivo seguido por enriquecimento seletivo e isolamento em meio ágar seletivo/diferencial. O uso de dois diferentes caldos de enriquecimento, assim como dois ou mais meios ágar seletivos, aumenta a sensibilidade do método. Após a incubação espalhar uma alça de meio de cultura obtido sobre a superfície de um meio ágar seletivo de modo a obter colônias isoladas. A menos que o contrário seja determinado, os caldos de enriquecimento podem ser refrigerados apenas se o impacto da refrigeração sobre os resultados tenha sido avaliado devendo ser claramente descrito em relatório de análise. Um número (geralmente cinco por placa) de colônias obtidas após a incubação é então identificado usando as técnicas de confirmação apropriadas. A seleção de colônias para confirmação deve cobrir colônias suspeitas. 11.3.

Medição de incertezas

A estimativa da incerteza de medição em determinações qualitativas encontra-se em estudo pela ISO/TC 34/SC 9. 12.

Métodos de confirmação

12.1.

Geral

Usar apenas culturas puras para confirmação bioquímicas e sorológicas. Os testes confirmatórios de referência são descritos nos Padrões específicos. Como alternativa para testes bioquímicos descritos nestes padrões específicos, métodos de confirmação descritos neste item (galerias bioquímicas, sondas de ácidos nucléicos) podem ser utilizados nas condições descritas neste item, a menos que o contrário seja determinado em Padrão Internacional específico. 12.2.

Preparação de cultura pura

50

Começar a seleção de uma cultura pura pela seleção de uma colônia única sobre ou dentro do ágar. Inocular então a colônia selecionada em um ágar não seletivo. Após a incubação, selecionar uma colônia bem isolada para testes subsequentes de confirmação. Repetir a operação caso necessário. Se possível, os testes de confirmação devem ser realizados usando uma única colônia. Caso não haja material celular suficiente em uma colônia, ela deve ser subcultivada em meio líquido ou em ágar inclinado, após a qual os testes confirmatórios podem ser utilizados. 12.3.

Coloração de Gram (técnica de Hucker modificada)

12.3.1. Geral Este meio de coloração de células bacterianas permite a descrição da morfologia da bactéria e classificação delas em dois grupos em função de capacidade de reter o corante cristal violeta (Gram +) nas condições de teste. Esta divisão de resultados baseia-se principalmente nas diferenças estruturais das paredes celulares dos dois grupos e isto coincide com outras grandes diferenças entre os grupos. Uma alternativa satisfatória à coloração de Gram é a utilização de 3% de solução de hidróxido de potássio (KOH). Uma alçada cheia de bactéria é misturada com duas gotas de solução de KOH. Bactérias Gramnegativas tornaram a solução viscosa e mucoide em 30 segundos, a ponto de formar fio quando do afastamento da alça. Há diversas maneiras de realizar a coloração de Gram, mas todas seguem a mesma sequencia abaixo. 12.3.2. Soluções 12.3.2.1. Geral Soluções comercialmente disponíveis podem ser utilizadas. Neste caso, seguir as recomendações do fabricante. 12.3.2.2. Solução de cristal violeta 12.3.2.2.1. Composição Cristal violeta

2,0 g

Etanol (95%)

20 ml

Oxalato de amônio (C2H8N2O4)

0,8 g

Água

80 ml

12.3.2.2.2. Preparação Dissolver o cristal violeta em etanol, e oxalato de amônio em água destilada. Misturar as duas soluções e reservar a mistura por 24 antes do uso. 12.3.2.3. Solução de lugol 12.3.2.3.1. Composição Iodo Iodeto de potássio (KI) Água

1,0 g 2,0 g 100 ml

12.3.2.3.2. Preparação

51

Dissolver o iodeto de potássio em 10 ml de água e adicionar o iodo em frações. Após a dissolução, completar para 100 ml em um recipiente volumétrico. 12.3.2.4. Solução de safranina 12.3.2.4.1. Composição Safranina Etanol (95%) Água

0,25 g 10 ml 100 ml

12.3.2.4.2. Preparação Dissolver a safranina em etanol e então misturar com água destilada. 12.3.3. Técnica de coloração Após a fixação por calor de um filme bacteriano em uma lâmina de microscopia preparada com uma cultura de 18h a 24h ou quando o caldo está turvo, cobrir o filme com cristal violeta. Deixar por 1 min. Enxaguar gentilmente a lâmina inclinada com água por alguns segundos. Cobrir a lâmina com solução de lugol. Deixar por 1 min. Enxaguar gentilmente a lâmina inclinada com água por alguns segundos. Despejar gentil e continuamente um filme de etanol 95% sobre a lâmina inclinada por não mais que 30 segundos até que não seja mais vista a coloração violeta. Gentilmente enxaguar a lâmina inclinada com água para eliminar o etanol. Cobrir a lâmina com a solução de safranina por 10 segundos. Enxaguar gentilmente a lâmina inclinada com água. Secar a lâmina. 12.3.4. Interpretação Observar a lâmina com uma objetiva imersão de alto poder em microscópio. As células bacterianas que aparecerem azuis ou violetas são chamadas Gram-positivas, enquanto aquelas coradas em rosa escuro ou vermelho são chamadas Gram-negativas. Para culturas puras de certas bactérias, células Gram-negativas e Gram-positivas podem estar presentes no mesmo campo. NOTA: Culturas densas de células podem fornecer repostas não características.

12.4.

Uso de galerias bioquímicas para identificação

Galerias bioquímicas disponíveis podem ser utilizadas para identificação de colônias isoladas. Verificar se as galerias são adequadas, de acordo com estudos de avaliação publicados na literatura científica 4 internacional, preferencialmente relacionadas a microbiologia de alimentos . Esta verificação é especialmente importante caso o fabricante não tenha dados de validação destas galerias.

4

Pedidos de informação devem ser enviados ao centro de referência nacional, regional ou internacional indicado para cada microrganismo.

52

O laboratório deve obter o certificado de controle para cada lote, com a identificação das linhagens testadas. O fabricante deve também especificar a linhagem controle que o laboratório pode usar para verificar a preservação do desempenho das galerias. As galerias devem incluir, minimamente, testes bioquímicos descritos em padrões específicos ou suplementados por outros testes. 12.5.

Uso de sondas nucléicas para identificação

Sondas nucléicas atualmente disponíveis podem ser utilizadas para identificação de colônias isoladas. Entretanto, verificar se as sondas nucleicas são adequadas, de acordo com estudos de avaliação publicados na literatura científica internacional, preferencialmente relacionadas a microbiologia de alimentos (ver e.g. Referência [23]). Esta verificação é especialmente importante caso o fabricante não tenha dados de validação destas galerias. O laboratório deve obter o certificado de controle para cada lote, com a identificação das linhagens testadas. O fabricante deve também especificar a linhagem controle que o laboratório pode utilizar para verificar a manutenção do desempenho da sonda. 12.6.

Métodos sorológicos

12.6.1. Geral Quando a confirmação sorológica é necessária, realiza-la após a identificação bioquímica de colônias isoladas. 12.6.2. Testes de aglutinação em lâmina Reações antígeno-anticorpo aglutinam células produzindo massas de flocos ou grânulos densos. No caso de bactérias da família Enterobacteriaceae, a reação entre antígeno “H” (i.e. flagelar) e este antissoro homólogo resulta em floculação, enquanto a reação envolvendo o antígeno “O” (i.e. somático) resulta em grânulo mais denso. Antes da aglutinação com o antissoro, um teste deve ser realizado para determinar se as células da bactéria aglutinam em solução de cloreto de sódio [3%(em massa)]. Caso as células bacterianas aglutinem, a linhagem é auto-agregativa e não deve ser aglutinada com antissoro. Antissoros comercialmente disponíveis são de dois tipos: antissoros polivalentes que reagem com microrganismos de um gênero em particular ou com um grupo de sorovares e que são adequados para uma varredura preliminar, e anticorpos monoclonais específicos, os quais permitem a identificação de sorovares particulares. O laboratório deve obter o certificado de controle para cada lote de antissoro, com a identificação das linhagens testadas. Verificar se o teste de aglutinação em lâmina é adequado, de acordo com estudos de avaliação publicados na 5 literatura científica internacional, preferencialmente relacionadas a microbiologia de alimentos . Quando da utilização dos reagentes, controles positivos e negativos adequados devem ser utilizados. 12.6.3. Teste de aglutinação com látex 5

Pedidos de informação devem ser enviados ao centro de referência nacional, regional ou internacional indicado para cada microrganismo.

53

Um método mais rápido e comercialmente disponível, empregando partículas de látex encapadas com anticorpos grupo-específicos (e.g. Escherichia coli O157, ver o padrão específico ISO 16654, ou Staphylococcus aureus na ISO 6888). O antígeno no extrato é testado contra diversos reagentes em látex. Verificar se o teste de aglutinação com látex é adequado, de acordo com estudos de avaliação publicados na 5 literatura científica internacional, preferencialmente relacionadas a microbiologia de alimentos . O laboratório deve obter o certificado de controle para cada lote, com a identificação das linhagens testadas. Quando da utilização dos reagentes, controles positivos e negativos adequados devem ser utilizados. 13. Relatório de análise O relatório de análise deve especificar o método utilizado, a temperatura de incubação, se necessário, e o resultado obtido. Ele deve mencionar também quaisquer detalhes operacionais não especificados neste Padrão Internacional, bem como aqueles considerados opcionais, junto de detalhes de eventuais incidentes que possam surtir efeito sobre os resultados. Determinar no relatório se análises posteriores devem ser realizadas por laboratórios de referência ou, no caso destes testes terem sido realizados, fora, de onde vieram esses resultados. O relatório de análise deve incluir toda informação para a identificação completa da amostra. Também é apropriado incluir toda informação necessária para a interpretação do resultado das análises. Se necessária, a medição de incerteza, determinada de acordo com a ISO/TS 19036, deve ser incluída no relatório de análise. 14.

Validação dos métodos microbiológicos

14.1.

Validação de métodos de referência

A validação dos métodos de referência está sendo realizada pela ISO/TC 34/SC 9. 14.2.

Validação de métodos alternativos

Consultar a ISO 16140 para protocolos técnicos de validação de métodos alternativos em relação aos métodos de referência. 14.3.

Validação de métodos internos

A validação dos métodos internos está sendo realizada pela ISO/TC 34/SC 9. 15.

Certificação de qualidade de resultados/controle de qualidade de desempenho

15.1.

Controle interno de qualidade

15.1.1. O controle interno de qualidade consiste em todos os procedimentos tomados pelo laboratório para a avaliação contínua de seu trabalho. O objetivo principal é garantir a consistência dos resultados no dia-a-dia e sua conformidade com critérios bem definidos. 15.1.2. Um programa de verificações periódicas é necessário para demonstrar que a variabilidade (entre análises, equipamentos e materiais) está sob controle. Todas as análises do âmbito de atividades do laboratório precisam ser englobadas. O programa pode envolver: 54

o uso de amostras enriquecidas, com variáveis níveis de contaminação, incluindo microbiota alvo e acompanhante; -

o uso de amostras enriquecidas ou naturalmente contaminadas de diferentes tipos de matrizes;

-

o uso de materiais de referência (incluindo materiais esquemáticos de testes de proficiência);

-

testes repetidos;

-

avaliações repetidas de resultados de testes.

O intervalo entre estas averiguações é influenciado pela natureza dos testes realizados pelo laboratório e frequência em que estes testes são realizados. Recomenda-se que, se possível, os testes devem incluir controles para monitorar o desempenho. 15.1.3. Em casos especiais, um laboratório pode realizar um teste em particular apenas ocasionalmente. É reconhecido que, em tais casos, um programa interno contínuo de controle de qualidade pode não ser apropriado e que um projeto para demonstração de desempenho satisfatório realizado em paralelo com o teste pode ser mais adequado. 15.2.

Linhagens de referência

Consultar a ISO 11133 para a manutenção de linhagens de referência. 15.3.

Avaliação externa de qualidade (teste de proficiência)

Os laboratórios devem participar regularmente de testes de proficiência que são relevantes para suas atividades. Deve-se dar preferência a testes de proficiência que utilizem as matrizes apropriadas. Os laboratórios devem utilizar avaliação externas de controle de qualidade não apenas para verificar os desvios do laboratório, mas também para verificar a validade global de seu sistema de qualidade.

55

ANEXO A (Informativo)

Propriedades de alguns desinfetantes Tabela A.1. – Propriedades de alguns desinfetantes Ativo contra Desinfetante

Materiais sintéticos

Água dura

Detergente

Pele

Olhos

Pulmões

+

+

+++

+

+

+

C

+

+

+

+

V

+

+

+

+

-

+++a

+

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+++

+++b

+

+

NA

+

+

+

NA

+++

+++

+++

+++

+

+

+

+++

+

+

+

A

+

+

-

+++

++

++

+++

+++

-

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

Hipocloritos

+

+++

Álcoois

-

+++

Formaldeído

+++

Glutaraldeído Iodóforos

b

Materiais naturais

Vírus envelopados

Gram negativas

a

Proteína

Esporos

Gram positivas

Toxicidade

Vírus não envelopados

Mycobacteria

Fungi

+++ ++ + V C A NA

Inativado por

Bacteria

+

Bom Regular Fraco Nulo Depende do vírus Catiônico Aniônico Não aplicável Acima de 40°C Acima de 20°C

Fonte: Referência [17]

56

ANEXO B (Normativo)

Determinação de número mais provável (NMP)

Tabela B.1. – Valores de NMP por porção teste e limites de confiança para 95% para séries de 10 tubos, calculados de acordo com a Referência [29]. Série de tubos Número de tubos positivos

Limites a 95%

NMP

Incerteza padrão do log10 NMP

Inferior

Superior

1

0,11

0,435

0,02

0,75

2

0,22

0,308

0,06

0,89

3

0,36

0,252

0,11

1,11

4

0,51

0,220

0,19

1,38

5

0,69

0,198

0,28

1,69

6

0,92

0,184

0,40

2,10

7

1,20

0,174

0,55

2,64

8

1,61

0,171

0,75

3,48

9

2,30

0,179

1,03

5,16

Tabela B.2. – Valores de NMP por porção teste e limites de confiança para 95% para séries de 15 tubos, calculados de acordo com a Referência [29]. Série de 15 tubos Número de tubos positivos

Limites a 95%

NMP


Inferior

Superior

1

0,07

0,434

0,01

0,49

2

0,14

0,307

0,04

0,57

3

0,22

0,251

0,07

0,69

4

0,31

0,218

0,12

0,83

5

0,41

0,196

0,17

0,98

6

0,51

0,179

0,23

1,15

7

0,63

0,167

0,30

1,33

8

0,76

0,157

0,37

1,55

9

0,92

0,150

0,47

1,80

10

1,10

0,144

0,57

2,11

11

1,32

0,141

0,70

2,49

12

1,61

0,139

0,86

3,02

13

2,01

0,142

1,06

3,82

14

2,71

0,155

1,35

5,45

57


Limites a 95%

NMP


Inferior

Superior

1

0,05

0,434

0,01

0,36

2

0,11

0,307

0,03

0,42

3

0,16

0,251

0,05

0,50

4

0,22

0,218

0,08

0,60

5

0,29

0,195

0,12

0,69

6

0,36

0,178

0,16

0,80

7

0,43

0,165

0,20

0.91

8

0,51

0,155

0,25

1,03

9

0,59

0,147

0,31

1,16

10

0,69

0,140

0,37

1,30

11

0,80

0,134

0,44

1,46

12

0,92

0,130

0,51

1,65

13

1,05

0,126

0,59

1,85

14

1,20

0,123

0,69

2,10

15

1,39

0,121

0,80

2,40

16

1,61

0,121

0,93

2,77

17

1,90

0,122

1,09

3,29

18

2,30

0,127

1,30

4,08

19

3,00

0,141

1,58

5,67

58


Limites a 95%

NMP


Inferior

Superior

1

0,04

0,434

0,01

0,29

2

0,08

0,307

0,02

0,33

3

0,13

0,251

0,04

0,40

4

0,17

0,217

0,07

0,47

5

0,22

0,195

0,09

0,54

6

0,27

0,178

0,12

0,61

7

0,33

0,165

0,16

0,69

8

0,39

0,154

0,19

0,77

9

0,45

0,146

0,23

0,86

10

0,51

0,139

0,27

0,96

11

0,58

0,133

0,32

1,06

12

0,65

0,128

0,37

1,16

13

0,73

0,123

0,42

1,28

14

0,82

0,119

0,48

1,41

15

0,92

0,116

0,54

1,55

16

1,02

0,113

0,61

1,70

17

1,14

0,111

0,69

1,88

18

1,27

0,109

0,78

2,09

19

1,43

0,108

0,88

2,33

20

1,61

0,108

0,99

2,62

21

1,83

0,109

1,12

2,99

22

2,12

0,111

1,29

3,50

23

2,53

0,117

1,49

4,28

24

3,22

0,123

1,77

5,85

59

Tabela B.5. – Índices MNP e limites de confiança (95%) quando três porções testes de 1 g (ml), três de 0,1 g (ml) e três de 0,01 g (ml) são utilizadas. Número de resultados positivos

Índice NMPa

Categoriab

Limites de confiança (95%)a,c Limite inferior

Limite superior

0,00

0,94

3

0,01

0,95

2

0,01

1

0,61

0

0,12

1,7

0

0,62

3

0,12

1,7

0

0,94

0

0,35

3,5

0

0

0,36

1

0,02

1,7

0

1

0,72

2

0,12

1,7

1

0

2

1,1

0

0,4

3,5

1

1

0

0,74

1

0,13

2

1

1

1

1,1

3

0,4

3,5

1

2

0

1,1

2

0,4

3,5

1

2

1

1,5

3

0,5

3,8

1

3

0

1,6

3

0,5

3,8

2

0

0

0,92

1

0,15

3,5

2

0

1

1,4

2

0,4

3,5

2

0

2

2,0

0

0,5

3,8

2

1

0

1,5

1

0,4

3,8

2

1

1

2,0

2

0,5

3,8

2

1

2

2,7

0

0,9

9,4

2

2

0

2,1

1

0,5

4

2

2

1

2,8

3

0,9

9,4

2

2

2

3,5

0

0,9

9,4

2

3

0

2,9

3

0,9

9,4

2

3

1

3,6

0

0,9

9,4

3

0

0

2,3

1

0,5

9,4

3

0

1

3,8

1

0,9

10,4

3

0

2

6,4

3

1,6

18,1

3

1

0

4,3

1

0,9

18,1

3

1

1

7,5

1

1,7

19,9

3

1

2

12

3

3

36

3

1

3

16

0

3

38

3

2

0

9,3

1

1,8

36

3

2

1

15

1

3

38

3

2

2

21

2

3

40

3

2

3

29

3

9

99

3

3

0

24

1

4

99

3

3

1

46

1

9

198

3

3

2

110

1

20

400

3

3

3

> 110

0

0

0

< 0,30

0

0

1

0,30

0

1

0

0,30

0

1

1

0

2

0

3

1 1

a

Fonte: Referência [27] b Ver Tabela B.6. c Os limites de confiança fornecidos nesta tabela são apenas para fornecer alguma ideia da influência de variações estatísticas nos resultados. Sempre haverá também outras fontes de variação, que podem algumas vezes ser até mesmo mais importantes.

60

Tabela B.6. – Explicação da categoria de resultados Categoria a

Definição

1

Quando o número de bactérias na amostra é igual ao NMP encontrado, o resultado é um dos que têm grandes probabilidades de ser obtido. Há no máximo 5% de chances de obter um resultado menos provável que a menor probabilidade nesta categoria.

2

Quando o número de bactérias na amostra é igual ao NMP encontrado, o resultado é um dos que têm menor probabilidade de ser obtido, menos ainda que o menos provável da categoria 1, mas há no máximo 1% de probabilidade de se obter um resultado menos provável do que a uma menor probabilidade nesta categoria.

3

Quando o número de bactérias na amostra é igual ao NMP encontrado, o resultado é um dos que têm menor probabilidade de ser obtido, menos ainda que o menos provável da categoria 2, mas há no máximo 0,1% de probabilidade de se obter um resultado menos provável do que a uma menor probabilidade nesta categoria.

0

Quando o número de bactérias na amostra é igual ao NMP encontrado, o resultado é um dos que têm menor probabilidade de ser obtido, menos ainda que o menos provável da categoria 3. Há apenas 0,1% de chance de se obter um resultado nesta categoria, sem que algo esteja errado.

a

Antes de começar o teste, deve ser decidido quais categorias devem ser aceitáveis, isto é, apenas 1, 1 e 2 ou até mesmo 1, 2 e 3. Quando a decisão a ser tomada com base nos resultados é de grande importância, apenas resultados na a categoria 1, ou no máximo a categoria 2,devem ser aceitos. Os resultados na categoria 0 devem ser considerados de grande suspeita.

61

Tabela B.7. – Valores de NMP por grama de amostra e limites de confiança de 95% (quando cinco porções teste de 1 g, cinco de 0,1 g e cinco de 0,01 g são utilizados).

Número de tubos apresentando resultados positivos 5 de 1 g

5 de 0,1 g

5 de 0,01 g

0

0

0

0

1

0

2

1 1

NMP (por grama)

Limites de confiança de 95% Inferior

Superior

<0,2

< 0,1

0,7

0

0,2

< 0,1

0,7

0

0,4

< 0,1

1,1

0

0

0,2

< 0,1

0,7

0

1

0,4

< 0,1

1,1

1

1

0

0,4

< 0,1

1,1

1

1

1

0,6

< 0,1

1,5

2

0

0

0,5

< 0,1

1,3

2

0

1

0,7

0,1

1,7

2

1

0

0,7

0,1

1,7

2

1

1

0,9

0,2

2,1

2

2

0

0,9

0,2

2,1

2

3

0

1,2

0,3

2,8

3

0

0

0,8

0,1

1,9

3

0

1

1,1

0,2

2,5

3

1

0

1,1

0,2

2,5

3

1

1

1,4

0,4

3,4

3

2

0

1,4

0,4

3,4

3

2

1

1,7

0,5

4,6

3

3

0

1,7

0,5

4,6

4

0

0

1,3

0,3

3,1

4

0

1

1,7

0,5

4,6

4

1

0

1,7

0,5

4,6

4

1

1

2,1

0,7

6,3

4

1

2

2,6

0,9

7,8

4

2

0

2,2

0,7

6,7

4

2

1

2,6

0,9

7,8

4

3

0

2,7

0,9

8

4

3

1

3,3

1,1

9,3

4

4

0

3,4

1,2

9,3

62

Tabela B.7. (Continuação) Número de tubos apresentando resultados positivos

NMP (por grama)

Limites de confiança de 95%

5 de 1 g

5 de 0,1 g

5 de 0,01 g

Inferior

Superior

5

0

0

2,3

0,7

7

5

0

1

3,1

1,1

8,9

5

0

2

4,3

1,5

11

5

1

0

3,3

1,1

9,3

5

1

1

4,6

1,6

12

5

1

2

6,3

2,1

15

5

2

0

4,9

1,7

13

5

2

1

7

2,3

17

5

2

2

9,4

2,8

22

5

3

0

7,9

2,5

19

5

3

1

11

3,1

25

5

3

2

14

3,7

34

5

3

3

18

4,4

50

5

4

0

13

3,5

30

5

4

1

17

4,3

49

5

4

2

22

5,7

70

5

4

3

28

9

85

5

4

4

35

12

100

5

5

0

24

6,8

75

5

5

1

35

12

100

5

5

2

54

18

140

5

5

3

92

30

320

5

5

4

160

64

580

5

5

5

> 180

-

-

63

Bibliografia

[1]

BELL, C., NEAVES, P. and WILLIAMS, A. P. Food microbiology and laboratory practice, Blackwell Science Ltd, Oxford, UK (2005)

[2]

ISO 9001, Quality management systems – Requirements

[3]

EA-Guidelines for the use of computers and computer systems in accredited laboratories, European cooperation for Accreditation (1998)

[4]

EA-4/10, Accreditation for microbiological laboratories, European cooperation for Accreditation (2002)

[5]

Food microbiology program requirements, based upon the FLAWG document United States accreditation criteria for laboratories performing food microbiological testing, American Association for Laboratory Accreditation (A2LA) (1998)

[6]

AS 1766, Australian standard methods for the microbiological examination of food – Part 1: General techniques and procedures update

[7]

BUTTIAUX, R., BEERENS, H. and TACQUET, A. Manuel de techniques bactériologiques, Éditions th Médicales Flammarion (4 edn,)

[8]

APHA Technical Committee on Microbiological Methods for Foods. Compendium of methods for the nd microbiological examination of foods, 2 edition, Speck, M. L., editor. Intersociety/Agency Committee on Microbiological Methods for Foods, American Public Health Association, Washington, DC, 1984

[9]

CRUICKSHANK, et al., Medical microbiology, Vol.2, 12 edn., Churchill-Livingstone, Edinburgh (1975)

[10]

D’AOUST, J. Y. Psychrotrophy and foodborne Salmonella. Int. J. Food Microbiol. 1991, 13, pp. 207-16

[11]

D’AOUST, J. Y., SEWELL, A. M., and McDONALD, C. Recovery of Salmonella spp. From refrigerated pre-enrichment cultures of dry food composites, J. AOAC. Int., 78, pp. 1322-7

[12]

D’AOUST, J. Y., SEWELL, A. M., and GRECO, P. Detection of Salmonella in dry foods using refrigerated pre-enrichment and enrichment broth cultures: summary of collaborative study. J. AOAC. Int., 1994, 77, pp.1490-1

[13]

D’AOUST, J. Y., SEWELL, A. M., and GRECO, P. Detection of Salmonella in dry foods using refrigerated pre-enrichment and enrichment broth cultures – Interlaboratory study, J. AOAC. Int., 1993, 76, pp.814-21.

[14]

DALSGAARD, A., GUARDABASSI, L., LUND, C. BAGGE, L. and GRAVESEN, J. Opbevaring af badevands-og drikkevandsprØver ved 0-5°C I et dØgn medfØrer en significant reduction I antal Escherichi coli og kimtal, Dansk. Vet. 2002 17, pp. 1-9

[15]

HARREWIJIN, G. A. and HARTOG, B. J. Guidelines to perform microbiological analyses of food and food products (“Good laboratory practice”), De Ware(n)-Chemicus 1979, 9, pp.1-11

[16]

MUIR, G. D., ed. Hazards in the chemical laboratory, Royal Institute of Chemistry, London (1971)

[17]

Laboratory biosafety manual, WHO, Geneva, 1993

[18]

LIGHTFOOT, N. F., MAIER, E. A. (eds). Microbiological analysis of food and water – Guidelines for quality assurance. Elsevier, Amsterdam, Netherlands (1998)

[19]

HARRIGAN, W. F. and McCANCE, M. E. Laboratory methods in food and dairy microbiology, Academic Press (1976)

th

64

[20]

Laboratory safety at the Centers for Disease Control (CDC), NHEW Publication No. CDC 79-8118, Atlanta, 1979

[21]

Laboratory safety at the Centers for Disease Control (CDC),US Dept of Health, Education and Welfare (Public Health Service), Atlanta, 1979

[22]

GERHARDT, P., MURRAY, R. G. E., COSTILLOW, R. N., NESTER, E. W., KRIEG, N. R. and PHILLIPS, G. B. eds. Manual of methods for general bacteriology. American Society for Microbiology, Washington, DC 20006 (1981)

[23]

GNANOU BESSE, N., AUDINET, N., BEAUFORT, A., COLIN, P., CORNU, M. and LOMBARD, B. A contribution to the improvement of Listeria monocytogenes enumeration in cold-smoked salmon. Int. J. Food Microbiol. 2004, 91, pp. 119-27

[24]

Microbiological testing laboratory accommodation guidelines, National Association of Testing Authorities, Australia

[25]

Microorganisms in food – 1: Their significance and methods of enumeration, ICMSF, University of Toronto Press (1968 update)

[26]

SHAPTON, D. A., BOARD, R. G. and HAUSTER, W. J. eds. Safety in microbiology, Society for Applied Bacteriology Technical Series No. 1 and No. 6, Academic Press (1972)

[27]

DE MAN, J. C. MPN tables (corrected), Eur. J. Appl. Biotechnol. 1983, 17, pp. 301-5

[28]

COCHRAN, W. G. Estimation of bacterial densities by means of the “Most Probable Number”. Biometrics 1950, 6, pp. 105-16

[29]

HURLERY, M. A. and ROSCOE, M. E. Automated statistical analysis of microbial enumeration by dilution series, J. Appl. Bacteriol. 1983, 55, pp. 159-64

[30]

NIEMELA, S. Statistical evaluation of results from microbiological examinations, Nordic Committee on nd Food Analysis (NMKL) Report No. 1, 2 edition (1983)

[31]

TAYLOR, J. The estimation of numbers of bacteria by tenfold dilution series, J. Appl. Bacteriol. 1962, 25, pp.54-61

[32]

HOLT, J. G., KRIEG, N. R., SNEATH, P. H. A., STALEY, J. T. and WILLIAMS, S. T. Bergey’s manual of th determinative bacteriology, 9 edn., Williams & Wilkins, Baltimore, MD, USA (1994)

[33]

KRIEG, N. R. and HOLT, J. G. Bergey’s manual of systematic bacteriology – Volume 1, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, USA (1984)

[34]

SNEATH, P. H. A. MAIR, N. S., SHARPE, M. E. and HOLT, J. G. Bergey’s manual of systematic nd bacteriology – Volume 2, 2 edition, Springer, New York, NY, 2001

[35]

KREGER-VAN RIJ, N. J. W. The yeasts – A taxonomic study, 3 edn., North-Holland Publiching Co., Amsterdam, Netherlands

[36]

THOMAS, H. A. Bacterial densities from fermentation tube tests, J. Am. Water Assoc. 1942, 34, pp. 572-6

[37]

ISO/IEC Guide 43-1, Proficiency testing by interlaboratory comparisons – Part 1: Development and operation of proficiency testing schemes

[38]

ISO 6888 (all parts), Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species)

rd

65

[39]

ISO 9998, Water quality – Practices for evaluating and controlling microbiological colony count media used in water quality tests

[40]

ISO/TR 13843, Water quality – Guidance on validation of microbiological methods

[41]

ISO 14461-1, Milk and milk products – Quality control in microbiological laboratories – Part 1: Analyst performance assessment for colony counts

[42]

ISO 14461-2, Milk and milk products – Quality control in microbiological laboratories – Part 2: Determination of reliability of colony counts of parallel plates and subsequent dilution steps

[43]

ISO 16654, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection of Escherichia coli O157

[44]

ISO/IEC 17025:2005, General requirements for the competence of testing and calibration laboratories

[45]

EN 12469, Biotechnology – Performance criteria for microbiological safety cabinets

[46]

ISO 17604, Microbiology of food and animal feeding stuffs – carcass sampling for microbiological analysis

[47]

ISO 18593, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for sampling techniques from surface using plates and swab methods

[48]

ISO Guide 99:1996, International vocabulary of basic and general in metrology

[49]

ISO/TC 34/SC 9 N852, ing document on the change from two to one plate per dilution for colony-count techniques (revision of ISO 7218), June 2007, Marie Cornu

66

Iso 7218_definiçoes Gerais.pdf 5j292k

Overview 5o1f4z

More details 6z3438

Related Documents c2h70

Iso 1240e

Iso 1240e

Iso 1240e

Iso 1400, Iso 1800 a2z2q

Iso Quant And Iso Cost 5u486m

Iso 8402 1994 Iso Definitions 4owq

More Documents from "Guto Steinhorst" 5f2j3e

Handbook Of Instrumental Techniques For Analytical Chemistry - Fran A.settle.pdf 226k1d

6g3p1u

Iso 21528-2 (2017) 70142l

Curso De Bateria (rui Motta).pdf 6u371

6g3p1u

Manual Do Baterista (rui Motta).pdf 6bw64