Electroforesis De Seroproteinas 381o3x

ELECTROFORESIS  

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La electroforesis es el movimiento de moléculas cargadas en un campo eléctrico. Un aparato de electroforesis consiste de un ánodo (+) y un cátodo (-) separado por acetato de celulosa en el cual migran las moléculas de Hb. Cuando una corriente eléctrica pasa a través del medio permite que las diferentes moléculas de proteinas con cargas eléctricas diversas migren a lo largo de la tira a velocidades diferentes. Después de un período especificado, la tira se retira y se tiñe. T. Haydée Zúñiga Cáceres

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ELECTROFORESIS DE SEROPROTEÍNAS 

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Método p separación de proteínas séricas (proteínas transport., anticuerpos, inhibs enzims, facts. de la coag., etc.) x su migración como partículas cargadas en un campo eléctrico. Usado p. seroproteínas, lipoproteínas, isoenzimas, hemoglobinas, haptoglobinas, glicoproteínas, etc. T. Haydée Zúñiga Cáceres

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En suero hum. existen + de 125 proteínas identificadas, con diversas funciones. Proteínas séricas totales o las proporciones de las fracciones proteicas cambian durante 1 variedad de enfs, por lo que cuantificarlas es de valor en el diagnóstico clínico.

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SOPORTES: CLASE I: Separan moléculas en base a la carga molecular neta. Ej.: materiales de capa delgada: papel, acetato de celulosa y gel de agarosa. Se obs. 5 bandas de proteínas séricas. CLASE II: Ade+ de la separación electrostática poseen un efecto de tamizado. Tamaño del poro del gel es del mismo orden que el de las proteínas. Ej.: almidón, gel de poliacril-amida. Actúan como trampas p las grandes molécs y las + peqs. migran sin impedim. El poder de resolución de estos geles es mucho >. Se visualizan 25 bandas o +. T. Haydée Zúñiga Cáceres

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BUFFERS y pH: NH2 | H | R

C

NH3+ | COO| R

NH3+ H

C

| COO-

H

C

COOH

| R

pH básico pH ácido Punto isoeléctrico

pH neutro

Las proteínas son moléculas anfóteras, son partículas no cargadas o cargadas positiva o negativamente según el pH del buffer. T. Haydée Zúñiga Cáceres

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Conociendo el valor del pH del punto isoeléctrico ( pI ) p. las susts a ser separadas, se puede elegir un buffer p. su separación; ej.: barbital, que no ppta ni desnaturaliza las proteínas y confiere una carga ( - ) a la mayoría de las proteínas séricas a pH 8.6. En un campo eléctrico, las moléculas de proteína negativamente cargadas migran hacia el ánodo. T. Haydée Zúñiga Cáceres

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ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA 

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Permite separar 5 a 6 bandas. C/fracción electroforética representa un conj. de proteínas. Útil p. el diagnóstico de gammopatías monoclonales, cirrosis hepática, insufic. renal, hipogammaglobulinemia, mieloma múltiple, etc.

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REACTIVOS: 1. BUFFER: Tris 6.05 g Barbital Na 10.30 Barbital 2.57 Agua c.s.p. 1 Litro 0.05)

( pH 8.6;

f.i.

Usar 100 mL p. humedecer tiras y 200 mL p. la cámara. Refrigerado sirve para 4 a 6 corridas. 2. COLORANTE: Disolver 1 cáps. de Rojo Ponceau S en 100 mL de ác. tricloroacético al 5 % 3. LAVADO: 300 mL de ác. acético 5 % (3 baños de 100 mL c/u) 4. SOLUCION DESHIDRATANTE: 100 mL. de metanol absoluto 5. SOL. CLARIFICADORA: 100 mL. de 12 % de ác. acético en metanol. T. Haydée Zúñiga Cáceres

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PROCEDIMIENTO: A) B) C) D) E) F)

SEPARACIÓN COLORACIÓN DECOLORACIÓN DESHIDRATACIÓN CLARIFICACIÓN CUANTIFICACIÓN: a) Scanneado en el densitómetro: b) Elución en NaOH 0.1 N c) Disolución en Acetona: Ac. acético glacial (1:1) Leer a 517 - 525 ηm vs el Bl. (disolución de 1 porción de la tira no coloreada). T. Haydée Zúñiga Cáceres

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Rangos normales de fracciones proteicas por electroforesis en acetato de celulosa Fracción Albúmina Globulinas: 1 2  

% del Total 54.0 - 74.0 1.1 4.6 7.3 8.1

-

4.2 13.0 13.5 19.9

Proteínas totales: 100.0

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g/dL 3.7 - 5.7 0.1 - 0.3 0.4 - 1.0 0.5 - 1.0 0.5 - 1.5 6.5 - 8.2

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Principales proteínas encontradas en cada fracción:  

Albúmina: Globulinas:  1: 1-antitripsina,  1-lipoproteínas,  1-

glucoproteína, Protrombina, Glob. fijadora de hormona tiroidea 2: 2-macroglobulina, Haptoglobina, Ceruloplasmina, 2-lipoproteínas, Eritropoyetina.

:

Transferrina,  -lipoproteínas, C3 y C4 componentes del complemento, Inactivador de estereasa C1, Hemopexina,

:

IgG, IgA, IgM, IgD, IgE. T. Haydée Zúñiga Cáceres

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ELECTROFORESIS DE SEROPROTEINAS NORMAL Y PATOLÓGICAS

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ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINAS

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Pauling e Itano en 1949: 1a identif. de 1 variante de Hb: HbS. Hb normal de un adulto en acetato de celulosa pta.: HbA: 95-98 % HbA2: < 3.5 % Anhidrasa carbónica I y II.

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Electroforesis en acetato de celulosa a pH alcalino 

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Principio: En tampón alcalino de trisEDTA-borato, pH 8,4, la > parte de las Hbs. tienen una carga negativa y en un campo eléctrico migran desde el punto de aplicación catódico hacia el ánodo ( + ). La electroforesis en acetato de celulosa es un método semicuantitativo de screening para las Hbs A, A 2, F, S, G, C, E, OyD T. Haydée Zúñiga Cáceres

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Preparación del hemolizado  Principio: La cuantificación y

  

diferenciación de las Hbs requiere de sangre hemolizada. La sangre anticoag. se conc. x centrifug. y hemoliza por adición de: Agua+congelamiento+cloroformo, ó Agua+ tolueno o solución de saponina. Glóbs bls, plaquetas, estroma y proteínas plasms se eliminan x centrifug y lavado con sol. salina. T. Haydée Zúñiga Cáceres

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Macrométodo 

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Centrif. 5 mL de sangre anticoag., remover el plasma y lavar los GRs 3 v. con sol. salina fisiológ. Elim. la sol. salina sobrenad. final y registrar el volumen de GR empaquetados. Por c/mL de GR añadir 1.5 mL de agua dest., agitar, y poner congelar. Remover y dejar descong 15’. Agregar 0.4 mL de cloroformo x mL de GR empaquetados. Agitar vigorosam. x 5’ y centrif. x 15’ a 3000 rpm. El hemolizado está en la capa superior. T. Haydée Zúñiga Cáceres

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Micrométodo

Reactivo: Reactivo lisante saponina: 1. Solución de reserva: Polvo de saponina 1 g. Agua c.s.p. 100 mL. 2. Solución de trabajo: Solución de reserva: 10 mL Agua 90 mL KCN al 3 %. 2 mL

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Procedimiento: 

Llenar 2 tubos heparinizados con sangre de punción dactilar. Cerrar 1 extremo con plastilina y centrifugar x 5’. Muestra estable x 1 sem. en nevera. Con lima realizar una muesca en c/tubo de Hcto a 1.6 cm x encima de la plastelina y romper el tubo. Vaciar la columna de GR empaquetados en un tubo de ensayo q contenga 6 gotas de Sol. de trabajo de saponina como agente hemolizante. Sacudir x 15’ p. sacar la sangre del tubo y hemolizarlo. T. Haydée Zúñiga Cáceres

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Procedimiento: Separación:  Igual que para seroproteínas, usando en vez de suero el hemolizado de los GR.  Buffer: Tampón Tris-EDTA-ácido bórico, pH 8.4:    

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Tris 10.2 g; EDTA 0.6 g, Ácido bórico 3.2 g Agua c.s.p. 10 dL.

Conectar a la fuente de poder a 250 voltios por 30 minutos. T. Haydée Zúñiga Cáceres

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Interpretación y comentarios: 

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Todas las Hbs se desplazan del pto de aplicación hacia el ánodo (+). El pto de aplicación puede ser poco visible y al mismo nivel 1 banda tenue de anhidrasa carbónica. Según su movilidad las variantes de la Hb pueden clasificarse en: Hbs lentas (A2, C, CHarlem, E y O) agrupadas en las proximidades del cátodo Hbs “intermedias” que se ubican entre la Hb C y A (S, Lepore, D, (G) y F) Hbs más rápidas (más anódicas) que la Hb A: (K-Woolwich, J, N, I, Bart’s y H). T. Haydée Zúñiga Cáceres

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Las Hbs con idéntica movilidad electroforética pueden diferenciarse x otros métodos. Ej.: pruebas de drepanocitemia, solubilidad, desnaturalización alcalina y electroforesis en agar-citrato. También pueden diferenciarse por consideraciones cuantitativas.

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La cantidad de Hb en cada banda se cuantifica mediante densitometría y luego son comparadas con la muestra normal. Las variantes de Hb anormal tienen alteración en las cargas debido a sustituciones únicas de aminoácido en sus cadenas de globina y este cambio en la carga eléctrica permite la separación entre la mayor parte de las variantes anormales de la Hb y la Hb A en un pH alcalino. Se puede cambiar el medio (de acetato de celulosa a gel de almidón) o su pH (de 6.2 a 8.6) para separar claramente las Hbs y expandir el rango de esta prueba más allá de las Hbs A1, A2, S y C

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Resultados normales: En los adultos las sgtes. Hbs son las más frecuentes: • Hb A1: 95% a 98% • Hb A2: 2% a 3% • Hb F: 0,8% a 2%

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