Colimetria Total 3y6m4
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AÑO DEL CENTENARIO DE MACCHU PICCHU PARA EL MUNDO UNIVERSIDAD PERUANA “LOS ANDES” FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA PRÁCTICA Nª
: 04
COLIMETRIA TOTAL Y FECAL
CÁTEDRA
: MICROBIOLOGIA APLICADA
CATEDRÁTICO JEFE DE PRÁCTICA ALUMNOS
: Mblgo. JAIME WESTER CAMPOS. : Mblgo. JAIME WESTER CAMPOS. : ANCO PANDURO, Raúl. COLLACHAGUA ECHEVARIA, Jhon PEREZ MERINO, Luis. VASQUEZ QUISPE, Diego.
CICLO
:
VIII
GRUPO
:
1
FECHA DE REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA: 15/10/09
HUANCAYO- PERU
INTRODUCCION
Se entiende por higiene de los productos alimenticios "el conjunto de medidas necesarias para garantizar la seguridad y salubridad de los productos alimenticios. Dichas medidas abarcan todas las fases posteriores a la producción primaria (entendiéndose por producción primaria los procesos de recolección, sacrificio,
ordeño
transformación,
y
similares),
envasado,
e
incluyen
almacenamiento,
preparación, transporte,
fabricación, distribución,
manipulación y venta o suministro al consumidor". Por lo dicho calidad higienico-sanitaria son "las características que debe cumplir un producto alimentario para asegurar que su consumo no implica un riesgo de salud para el consumidor.".
OBJETIVOS
Objetivo General:
Determinar la presencia de agentes patógenos en muestra de CEVICHE que podrían ser causantes de enfermedades.
Objetivos Específicos: •
Realizar la técnica de colimetria total que se basa en la cuantificación aproximada de enterobacterias del grupo coliforme(Escherichia, Klebsiela, citrobacter y enterobacter) que puedan estar presentes en nuestra muestra de CEVICHE.
•
Realizar la técnica
de colimetria fecal en caso de dar
positivo la técnica anterior Escheriachia coli fecal.
para la cuantificación
de
I. FUNDAMENTO TEORICO
ENTEROBACTERIAS. Las enterobacteriáceas (Enterobacteriaceae) son una familia de bacterias Gram negativas que contiene más de 30 géneros y más de 100 especies que pueden tener morfología de bacilos o cocos. Los de esta familia forman parte de la microbiota del intestino (llamados coliformes) y de otros órganos del ser humano y de otras especies animales. Algunas especies pueden vivir en tierra, en plantas o en animales acuáticos. Sucumben con relativa facilidad a desinfectantes comunes, incluido el cloro. Con frecuencia se encuentran especies de Enterobacteriaceae en la bio-industria: para la fermentación de quesos y productos lácteos, alcoholes, tratamientos médicos, producción de toxinas en el uso de cosméticos, fabricación de agentes antivirales de la industria farmacéutica, etc. CARACTERISTICAS. En la definición clásica de una Enterobacteriaceae se usan siete criterios básicos, adicional a la aparición de nuevos métodos taxonómicos para
incluir a ciertos géneros que no cumplen con todos los siguientes criterios, pero que forman parte de esta familia: •
Son
bacterias
gram
negativas,
la
mayoría
bacilos,
otros
cocobacilos y otros pleomórficos. •
No son exigentes, son de fácil cultivo.
•
Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa positivo), es decir, carecen de la enzima citocromo oxidasa.1
•
Son capaces de reducir nitrato en nitrito.
•
Son anaeróbicos facultativos.
•
Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaeróbicas con o sin la producción de gas (en especial glucosa y lactosa), y oxidadores de una amplia gama de substratos en condiciones aeróbicas.2
•
Muchos géneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos géneros no son móviles.
Adicional a ello, las Enterobacteriaceae no forman esporas, algunas producen toxinas y pueden ser encapsuladas y son organismos catalasa positivos. Son quimioheterótrofos, y necesitan para su crecimiento compuestos simples de carbono y nitrógeno, generalmente sólo con Dglucosa, aunque algunas requieren aminoácidos y vitaminas. La temperatura óptima de crecimiento es de entre 22 °C y 37 °C.
Las diferencias entre los nombres de los diversos géneros provienen de criterios más precisos, como la fermentación de los diferentes azúcares, la producción o no de azufre, la presencia de enzimas metabólicas (βgalactosidasa, desaminasas, descarboxilasas), etc. Los serotipos de importancia medica y sanitaria pueden distinguirse entre sí por la presencia o ausencia de antígenos en su constitución celular, tales como en el lipopolisacárido (antígeno O), el antígeno flagelar (antígeno H) o el antígeno capsular (antígeno K). ECOLOGIA. En el intestino, representan una fracción importante de la flora aeróbica, se encuentran en grandes números en el colon (desde el ciego hasta el recto), donde contribuyen a la degradación de residuos alimenticios y a la producción de gas intestinal como parte de la fermentación. La especie Escherichia coli juega una función importante en el control de otras especies intestinales, constituyendo cerca del 80 por ciento de la flora aeróbica intestinal en una concentración aproximada de 108 en la materia fecal. Otras especies de Enterobacteriaceae con una presencia numerosa intestinal son Proteus y Klebsiella, mientras que otras especies, como Citrobacter, Hafnia, Providencia y Enterobacter están presentes de manera irregular.
En ciertas oportunidades, los comensales del intestino pueden resultar patogénicos como oportunistas en infecciones urinarias, pulmonía, septicemia o sobreinfecciones, en especial en inmunosuprimidos, en el uso de ciertos antibióticos, desnutrición, etc. PATOGENICIDAD. La presencia de Enterobacteriaceae dentro del organismo es anormal y determina la aparición de infecciones, cuya gravedad depende del punto de entrada. Introducidas por los alimentos, provocan problemas intestinales
al
adherirse
y
atravesar
la
barrera
de
la
mucosa
gastrointestinal, manifestada por diarreas y deshidratación. Ciertas especies provocan patologías específicas: •
La especie Salmonella typhi es responsable de la fiebre tifoidea.
•
La especie Shigella dysenteriae es el agente responsable de la disentería bacilar.
•
La especie Escherichia coli enterotóxica es responsable de la gastroenteritis infantil.
•
La especie Yersinia pestis es responsable de la peste.
•
La especie Serratia marcescens usualmente causa infecciones nosocomiales como resultado de tratamiento en un hospital.
Las Enterobacteriaceae incluyen a organismos que resultan patógenos para el ser humano como la Escherichia coli o la Salmonella,
especialmente importantes en la mortalidad infantil en países en desarrollo y patógenos para las plantas como Erwinia, en la mayor parte de los casos causando infecciones oportunistas. Todos los bacilos de Enterobacteriaceae son resistentes a antimicrobianos comunes, tales como la penicilina, la meticilina y la clindamicina, entre otros. TECNICAS UTILES PARA ELCONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS Fundamento El cultivo de microorganismos tiene por objeto su estudio e identificación, que se efectúa mediante las características que presentan las bacterias. Dichas características dependen del comportamiento de las poblaciones, más que de los organismos individualmente, de ahí que sean importantes los materiales y métodos para conseguir el desarrollo y la multiplicación.
DETERMINACION DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP) DE GERMENES EN UN ALIMENTO El recuento por dilución proporciona una idea del número de organismos vivos presentes en una muestra que son capaces de multiplicarse en un medio líquido determinado. Se elige un medio líquido capaz de mantener el crecimiento de las bacterias que se están estudiando.Este método se utiliza cuando se sospeche un número muy bajo de gérmenes.
II. METODOLOGÍA MATERIALES Y EQUIPOS REQUERIDOS: Materiales de Laboratorio: 3 Tubo de ensayo (16x150) 1 Pipeta de 1ml 6 Placas Petri 2 Matraces 2 Baguetas Pizeta Equipos: Balanza Horno esterilizador Estufa o incubadora Autoclave Mechero Bunssen
Muestra: Ceviche
III. PROCEDIMIENTO
Preparación del caldo Material: •
Caldo nutritivo en tubos, estéril.
•
Alimento problema o dilución de éste.
•
Asa de siembra.
•
Mechero.
•
Estufa de 37° C.
Método: •
Sembrar en tubo con caldo nutritivo un asa del alimento problema o de la dilución.
•
Llevar a la estufa a 37° C.
•
Observar a las 48 horas el tipo de crecimiento
Determinacion del numero Mas Probable (Nmp) .de Germenes En Un Alimento Material •
Tres series (o más) de cinco tubos (cada serie) con el medio de cultivo adecuado, según microorganismo.
•
Botes de dilución con 90 mL de agua de peptona al 0.1% y pH= 6.8-7, estéril.
•
Material diverso según el tipo de alimento a analizar.
Método •
Hacer diluciones del alimento al 1/10. 1/100. 1/1000 o más si fuera necesario. (ver protocolo de diluciones).
•
Poner 1 mL de la última dilución en cada uno de los tubos de la última serie.
•
Hacer lo mismo con las demás diluciones de manera ascendente .
•
Incubar el tiempo necesario y a la temperatura adecuada según el que queramos investigar.
•
Pasado el tiempo de incubación hacer la lectura y anotar el número de tubos positivos de cada serie.
•
Consultar las tablas de probabilidad con el número de tubos positivos, Estos resultados se expresarán como número más probable de microorganismos por gramo o mililitro de alimento.
ESQUEMA DE TRABAJO PARA REALIZAR COLIMETRIA TOTAL
MUESTR A
1 m L
10-1
1 m L
10-2
10-3 Dilucione s seriadas
Caldo brilla 10ml c/tubo mas campana Durham 10-1
10-2
Colimetria total Incubacion a baño maria a 37ºC x 48 h
Verficar gas y turbidez. Cotejar con la tabla NMP.
10-3
CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA PRÁCTICA Nª
: 04
COLIMETRIA TOTAL Y FECAL
CÁTEDRA
: MICROBIOLOGIA APLICADA
CATEDRÁTICO JEFE DE PRÁCTICA ALUMNOS
: Mblgo. JAIME WESTER CAMPOS. : Mblgo. JAIME WESTER CAMPOS. : ANCO PANDURO, Raúl. COLLACHAGUA ECHEVARIA, Jhon PEREZ MERINO, Luis. VASQUEZ QUISPE, Diego.
CICLO
:
VIII
GRUPO
:
1
FECHA DE REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA: 15/10/09
HUANCAYO- PERU
INTRODUCCION
Se entiende por higiene de los productos alimenticios "el conjunto de medidas necesarias para garantizar la seguridad y salubridad de los productos alimenticios. Dichas medidas abarcan todas las fases posteriores a la producción primaria (entendiéndose por producción primaria los procesos de recolección, sacrificio,
ordeño
transformación,
y
similares),
envasado,
e
incluyen
almacenamiento,
preparación, transporte,
fabricación, distribución,
manipulación y venta o suministro al consumidor". Por lo dicho calidad higienico-sanitaria son "las características que debe cumplir un producto alimentario para asegurar que su consumo no implica un riesgo de salud para el consumidor.".
OBJETIVOS
Objetivo General:
Determinar la presencia de agentes patógenos en muestra de CEVICHE que podrían ser causantes de enfermedades.
Objetivos Específicos: •
Realizar la técnica de colimetria total que se basa en la cuantificación aproximada de enterobacterias del grupo coliforme(Escherichia, Klebsiela, citrobacter y enterobacter) que puedan estar presentes en nuestra muestra de CEVICHE.
•
Realizar la técnica
de colimetria fecal en caso de dar
positivo la técnica anterior Escheriachia coli fecal.
para la cuantificación
de
I. FUNDAMENTO TEORICO
ENTEROBACTERIAS. Las enterobacteriáceas (Enterobacteriaceae) son una familia de bacterias Gram negativas que contiene más de 30 géneros y más de 100 especies que pueden tener morfología de bacilos o cocos. Los de esta familia forman parte de la microbiota del intestino (llamados coliformes) y de otros órganos del ser humano y de otras especies animales. Algunas especies pueden vivir en tierra, en plantas o en animales acuáticos. Sucumben con relativa facilidad a desinfectantes comunes, incluido el cloro. Con frecuencia se encuentran especies de Enterobacteriaceae en la bio-industria: para la fermentación de quesos y productos lácteos, alcoholes, tratamientos médicos, producción de toxinas en el uso de cosméticos, fabricación de agentes antivirales de la industria farmacéutica, etc. CARACTERISTICAS. En la definición clásica de una Enterobacteriaceae se usan siete criterios básicos, adicional a la aparición de nuevos métodos taxonómicos para
incluir a ciertos géneros que no cumplen con todos los siguientes criterios, pero que forman parte de esta familia: •
Son
bacterias
gram
negativas,
la
mayoría
bacilos,
otros
cocobacilos y otros pleomórficos. •
No son exigentes, son de fácil cultivo.
•
Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa positivo), es decir, carecen de la enzima citocromo oxidasa.1
•
Son capaces de reducir nitrato en nitrito.
•
Son anaeróbicos facultativos.
•
Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaeróbicas con o sin la producción de gas (en especial glucosa y lactosa), y oxidadores de una amplia gama de substratos en condiciones aeróbicas.2
•
Muchos géneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos géneros no son móviles.
Adicional a ello, las Enterobacteriaceae no forman esporas, algunas producen toxinas y pueden ser encapsuladas y son organismos catalasa positivos. Son quimioheterótrofos, y necesitan para su crecimiento compuestos simples de carbono y nitrógeno, generalmente sólo con Dglucosa, aunque algunas requieren aminoácidos y vitaminas. La temperatura óptima de crecimiento es de entre 22 °C y 37 °C.
Las diferencias entre los nombres de los diversos géneros provienen de criterios más precisos, como la fermentación de los diferentes azúcares, la producción o no de azufre, la presencia de enzimas metabólicas (βgalactosidasa, desaminasas, descarboxilasas), etc. Los serotipos de importancia medica y sanitaria pueden distinguirse entre sí por la presencia o ausencia de antígenos en su constitución celular, tales como en el lipopolisacárido (antígeno O), el antígeno flagelar (antígeno H) o el antígeno capsular (antígeno K). ECOLOGIA. En el intestino, representan una fracción importante de la flora aeróbica, se encuentran en grandes números en el colon (desde el ciego hasta el recto), donde contribuyen a la degradación de residuos alimenticios y a la producción de gas intestinal como parte de la fermentación. La especie Escherichia coli juega una función importante en el control de otras especies intestinales, constituyendo cerca del 80 por ciento de la flora aeróbica intestinal en una concentración aproximada de 108 en la materia fecal. Otras especies de Enterobacteriaceae con una presencia numerosa intestinal son Proteus y Klebsiella, mientras que otras especies, como Citrobacter, Hafnia, Providencia y Enterobacter están presentes de manera irregular.
En ciertas oportunidades, los comensales del intestino pueden resultar patogénicos como oportunistas en infecciones urinarias, pulmonía, septicemia o sobreinfecciones, en especial en inmunosuprimidos, en el uso de ciertos antibióticos, desnutrición, etc. PATOGENICIDAD. La presencia de Enterobacteriaceae dentro del organismo es anormal y determina la aparición de infecciones, cuya gravedad depende del punto de entrada. Introducidas por los alimentos, provocan problemas intestinales
al
adherirse
y
atravesar
la
barrera
de
la
mucosa
gastrointestinal, manifestada por diarreas y deshidratación. Ciertas especies provocan patologías específicas: •
La especie Salmonella typhi es responsable de la fiebre tifoidea.
•
La especie Shigella dysenteriae es el agente responsable de la disentería bacilar.
•
La especie Escherichia coli enterotóxica es responsable de la gastroenteritis infantil.
•
La especie Yersinia pestis es responsable de la peste.
•
La especie Serratia marcescens usualmente causa infecciones nosocomiales como resultado de tratamiento en un hospital.
Las Enterobacteriaceae incluyen a organismos que resultan patógenos para el ser humano como la Escherichia coli o la Salmonella,
especialmente importantes en la mortalidad infantil en países en desarrollo y patógenos para las plantas como Erwinia, en la mayor parte de los casos causando infecciones oportunistas. Todos los bacilos de Enterobacteriaceae son resistentes a antimicrobianos comunes, tales como la penicilina, la meticilina y la clindamicina, entre otros. TECNICAS UTILES PARA ELCONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS Fundamento El cultivo de microorganismos tiene por objeto su estudio e identificación, que se efectúa mediante las características que presentan las bacterias. Dichas características dependen del comportamiento de las poblaciones, más que de los organismos individualmente, de ahí que sean importantes los materiales y métodos para conseguir el desarrollo y la multiplicación.
DETERMINACION DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP) DE GERMENES EN UN ALIMENTO El recuento por dilución proporciona una idea del número de organismos vivos presentes en una muestra que son capaces de multiplicarse en un medio líquido determinado. Se elige un medio líquido capaz de mantener el crecimiento de las bacterias que se están estudiando.Este método se utiliza cuando se sospeche un número muy bajo de gérmenes.
II. METODOLOGÍA MATERIALES Y EQUIPOS REQUERIDOS: Materiales de Laboratorio: 3 Tubo de ensayo (16x150) 1 Pipeta de 1ml 6 Placas Petri 2 Matraces 2 Baguetas Pizeta Equipos: Balanza Horno esterilizador Estufa o incubadora Autoclave Mechero Bunssen
Muestra: Ceviche
III. PROCEDIMIENTO
Preparación del caldo Material: •
Caldo nutritivo en tubos, estéril.
•
Alimento problema o dilución de éste.
•
Asa de siembra.
•
Mechero.
•
Estufa de 37° C.
Método: •
Sembrar en tubo con caldo nutritivo un asa del alimento problema o de la dilución.
•
Llevar a la estufa a 37° C.
•
Observar a las 48 horas el tipo de crecimiento
Determinacion del numero Mas Probable (Nmp) .de Germenes En Un Alimento Material •
Tres series (o más) de cinco tubos (cada serie) con el medio de cultivo adecuado, según microorganismo.
•
Botes de dilución con 90 mL de agua de peptona al 0.1% y pH= 6.8-7, estéril.
•
Material diverso según el tipo de alimento a analizar.
Método •
Hacer diluciones del alimento al 1/10. 1/100. 1/1000 o más si fuera necesario. (ver protocolo de diluciones).
•
Poner 1 mL de la última dilución en cada uno de los tubos de la última serie.
•
Hacer lo mismo con las demás diluciones de manera ascendente .
•
Incubar el tiempo necesario y a la temperatura adecuada según el que queramos investigar.
•
Pasado el tiempo de incubación hacer la lectura y anotar el número de tubos positivos de cada serie.
•
Consultar las tablas de probabilidad con el número de tubos positivos, Estos resultados se expresarán como número más probable de microorganismos por gramo o mililitro de alimento.
ESQUEMA DE TRABAJO PARA REALIZAR COLIMETRIA TOTAL
MUESTR A
1 m L
10-1
1 m L
10-2
10-3 Dilucione s seriadas
Caldo brilla 10ml c/tubo mas campana Durham 10-1
10-2
Colimetria total Incubacion a baño maria a 37ºC x 48 h
Verficar gas y turbidez. Cotejar con la tabla NMP.
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