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BIOTECNOLOGIA •

En términos generales biotecnología se puede definir como el uso de organismos vivos o de compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener productos de valor para el hombre.

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Por tanto, podemos decir que la biotecnología abarca desde la biotecnología tradicional, muy conocidas y establecidas, y por tanto utilizadas, como por ejemplo la fermentación de alimentos, hasta la biotecnología moderna, basada en la utilización de las nuevas técnicas del DNA recombinante (ingeniería genética), los anticuerpos monoclonales y los nuevos métodos de cultivo de células y tejidos.

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La biotecnología moderna está compuesta por una variedad de técnicas derivadas de la investigación en biología celular y molecular. Estas técnicas involucran la manipulación deliberada de moléculas de DNA con la finalidad de la aplicación comercial de organismos vivos modificados o de sus productos. Pueden ser utilizadas en cualquier industria que utilice microorganismos o células vegetales o animales.

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Biotecnología microbiana Es la disciplina que utiliza los microorganismos vivos o sus productos en procesos industriales. La biotecnología microbiana se puede dividir en dos fases distintas: 1. Tecnología microbiana tradicional, que se refiere a la fabricación a gran escala de productos que los microorganismos son capaces de fabricar. 2. Tecnología microbiana con organismos alterados genéticamente mediante procesos de ingeniería genética.

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Microorganismos Industriales y Productos Industriales

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Su fuente es la naturaleza No todos los microorganismos (MOs) tienen uso industrial Los hongos (levaduras y mohos) y algunos procariotas (Streptomyces) son los mas usados. Se seleccionan los que producen uno o mas productos de interés Se modifican géneticamente por mutación o recombinación para aumentar el o los metabolitos de interés. Las vías metabólicas menores se reprimen o eliminan. Pueden presentar propiedades de desarrollo pobres, pérdida en la capacidad de esporulación, propiedades bioquímicas y celulares alteradas. Las cepas modificadas son conservadas en los laboratorios de microbiología de las industrias y en distintas colecciones nacionales de microorganismos tipo.

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Colecciones Nacionales de microorganismos tipo Están disponibles para fines docentes, de investigación o industriales. Las cepas que producen los mejores rendimientos (con derechos de propiedad o patentadas) no están en estas colecciones.

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Mejoramiento de la cepa de Penicillum chrysogenum, productora de la penicilina. A través de los años y de numerosos procesos la producción de penicilina por el hongo Penicillum chrysogenum pasó de 1-10 ug/ml a 50.000 ug/ml. Este incremento de 50.000 veces se obtuvo por el mejoramiento de la cepa a través de mutación y selección sin incluir manipulación genética y por cambios en el medio y en las condiciones de crecimiento. La introducción de nuevas técnicas genéticas condujo posteriormente a incrementos mucho mas modestos en el rendimiento. Conjunto de mutaciones realizadas por cuatro grupos de investigadores para obtener una cepa de Penicillum chrysogenum capaz de sintetizar penicilina para una exportación comercial. “S”, mutación espontánea; “X”, rayos X; “UV”, radiación ultra violeta; “NM”, gas mostaza. Los métodos fermentativos habituales rinden más de 20 g/litr

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Requisitos de un microorganismo industrial El microorganismo debe: 1- Producir la sustancia de interés 2- Obtenerse en cultivo puro 3- Ser genéticamente estable. 4- Poder desarrollarse en cultivos a gran escala. 5- Poder mantener el cultivo del MO durante períodos largos en el laboratorio y en la planta industrial. 6- Tener un tiempo de duplicación bajo y fabricar el producto deseado en un período corto. Crecimiento rápido → ocupar menos tiempo los equipos industriales → disminuir los riesgos de contaminación. → mejor control de los factores ambientales 7- Ser susceptible de manipulación genética. 8-Crecer en medio de cultivo líquido relativamente barato y que se obtenga en grandes cantidades.

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Medios de cultivo industriales Se usan muchas veces como medios de cultivo a gran escala desechos carbonados provenientes de otras industrias. -licor de maceración del maíz (rico en nitrógeno y factores de crecimiento). - suero de leche (contiene lactosa y minerales) -otros materiales residuales de la industria con elevado contenido en carbono orgánico. 9- En la industria se prefieren los MOs grandes como los hongos, levaduras y bacterias filamentosas para poder separar las células microbianas del medio de cultivo con facilidad ya que este proceso es muy costoso a gran escala. Es mas económico efectuar la separación por filtración que por centrifugación.

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Condiciones que no debe tener un microorganismo industrial Los microorganismos industriales no deben: • 1- ser peligrosos para el hombre, animales y plantas de interés económico. • 2- liberar toxinas, o si lo hacen deben poder ser eliminadas fácilmente.

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Los productos industriales de interés pueden ser de varios tipos: 1- Las células propiamente dichas, por ej. las levaduras cultivadas para alimentos, panadería o cerveza. 2- Las sustancias producidas por las células. Ejemplos de estas últimas son: - las enzimas como la glucosa isomerasa - agentes farmacológicos activos como los antibióticos, esteroides y alcaloides - productos químicos y aditivos alimentarios como el aspartame, edulcorante de alimentos y bebidas de bajas calorías (fabricado a partir de L-fenilalanina mas L-ácido aspártico); el L-glutamato, utilizado para reforzar el sabor y para ablandar las carnes; el Laspartato y alanina para enriquecer el sabor de jugos de fruta; la glicina para mejorar el sabor de alimentos edulcorados; la Llisina y la DL-metionina como aditivos nutritivos en alimentos para animales.

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Productos Industriales

Varias enzimas importantes de uso comercial son producidas por MOs, incluyendo enzimas que digieren el almidón (amilasas), proteínas (proteasas, renina) y las grasas (lipasas). Penicilina acilasa es usada para producir penicilinas sintéticas. Los metabolitos microbianos son otro grupo importante de productos industriales. Estos metabolitos pueden ser productos de la fermentación como el etanol, ac. acético o ac. láctico; factores de crecimiento claves como los aminoácidos, las vitaminas, antibióticos, esteroides, alcaloides, etc. Los agentes farmacológicamente activos están por lo general en la categoría de metabolitos secundarios.

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Crecimiento y formación de productos en procesos industriales El crecimiento microbiano comprende distintas etapas: fase de latencia, fase exponencial y fase estacionaria. Procesos donde lo que interesa es el metabolito microbiano. Hay dos tipos básicos de metabolito microbiano: 1- metabolito primario es el que se fabrica durante la fase exponencial del crecimiento del microorganismo. 2- metabolito secundario es el que se fabrica cerca del final de la fase logarítmica de crecimiento, con frecuencia , cerca de la fase estacionaria de crecimiento.

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Comparación entre metabolitos primarios y secundarios Metabolitos microbianos primarios Un proceso típico microbiano en el cual el producto de interés se forma durante la fase primaria de crecimiento es la fermentación alcohólica (etanólica). El etanol es un producto del metabolismo anaeróbico de la levadura y de ciertas bacterias, y se forma como parte del metabolismo energético. Dado que el crecimiento sólo se puede dar si se efectúa la producción de energía, la producción de etanol corre paralelamente con el crecimiento. Metabolismo microbiano secundario Los metabolitos producidos durante la fase estacionaria suelen llamarse metabolitos secundarios y son algunos de los más comunes e importantes de interés industrial. Este es el caso de la mayoría de los compuestos de interés farmacológico como es el caso de los antibióticos por ejemplo.

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Comparación entre metabolitos primarios y secundarios a) Metabolismo primario: formación de alcohol por la levadura. b) Metabolismo secundario: formación de penicilina por el hongo Penicillium chrysogenum, presentando la separación de la fase de crecimiento (trofofase), y la fase de producción (idiofase). Nótese en b) que la penicilina no se produce hasta que el crecimiento ha entrado en la fase media y mayor parte del producto se forma después de que el crecimiento ha entrado a la fase estacionaria. En ambos gráficos a) y b) los ejes son aritméticos y no logarítmicos.

a

b

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Trofofase e idiofase. En el metabolismo secundario, las dos fases distintas del metabolismo se denominan trofofase e idiofase. La trofofase es la fase de crecimiento (el prefijo trofos, significa "crecimiento" ) mientras que la fase de producción de metabolitos es la idiofase. Si estamos tratando con un metabolito secundario debemos asegurar que durante la trofofase se proporcionen las condiciones apropiadas para un excelente crecimiento y que las condiciones se alteren adecuadamente y en el momento oportuno para que la formación del producto sea excelente.

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Mientras que el metabolismo primario es generalmente similar en todas las células, el metabolismo secundario presenta claras diferencias entre un organismo y otro. Las características reconocidas del metabolismo secundario son: 1- Cada metabolito secundario sólo lo forman relativamente pocos organismos. 2- Los metabolitos secundarios aparentemente no son esenciales para el crecimiento y la reproducción. 3- La formación de metabolitos secundarios depende fundamentalmente de las condiciones de cultivo, sobre todo de la composición del medio. Con frecuencia, se produce la represión de la formación del metabolito secundario. 4- Los metabolitos secundarios se producen como un grupo de estructuras muy relacionadas. Por ejemplo, se ha encontrado que una sola cepa de Streptomyces produce alrededor de 30 antibióticos distintos, pero relacionados, del tipo antraciclina. 5- Se puede incrementar enormemente la sobreproducción de los metabolitos secundarios, mientras que los metabolitos primarios asociados al metabolismo primario, habitualmente no pueden sobreproducirse en la misma medida.

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Las vía metabólicas del metabolismo secundario surgen del metabolismo primario. •

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El metabolito secundario, generalmente se produce a partir de varios productos intermediarios acumulados ya sea en el medio de cultivo o en las células, durante el metabolismo primario. Las enzimas que intervienen en la producción de metabolito secundario se regulan por separado de las del metabolismo primario. En algunos casos se han identificado inductores de metabolitos secundarios por ejemplo, se ha identificado un inductor específico para la producción de estreptomicina, compuesto que se llama factor-A. La mayor parte de los metabolitos secundarios son moléculas orgánicas complejas que requieren una gran cantidad de reacciones enzimáticas específicas para su síntesis, (72 etapas para tetraciclina; 25 etapas para eritromicina).

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Características de la fermentación en gran escala En microbiología industrial, el término fermentación se refiere a cualquier proceso microbiano a gran escala, tanto si se realiza aeróbica como anaeróbicamente, es decir tanto si es o no bioquímicamente una fermentación. De hecho la mayor parte de las fermentaciones industriales son aeróbicas. El tanque en el cual se lleva a cabo la fermentación industrial se llama fermentador y el microorganismo que se utiliza se llama fermento. El fermentador puede variar de tamaño de la escala pequeña de laboratorio (5 -10 litros) a la enorme escala industrial (400.000 litros). Las dimensiones dependen del tipo de proceso y de cómo opera. Los procesos manejados en lote o batch requieren fermentadores más grandes que los que operan en forma contínua o semicontínua. Los fermentadores industriales se pueden dividir en dos clase principales, para procesos anaeróbicos y para procesos aeróbicos. Los fermentadores anaeróbicos requieren poco equipo especial, excepto para la remoción del calor generado durante la fermentación, en tanto que los fermentadores aeróbicos requieren equipo mucho más elaborado para asegurar la correcta mezcla y aireación.

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Construcción de un fermentador aeróbico Los fermentadores a gran escala son casi siempre de acero inoxidable. Es prácticamente un cilindro grande cerrado por arriba y por abajo, dentro del cual se han ajustado varios tubos y válvulas. Tiene una cubierta externa de enfriamiento, a través de la cual se hace pasar vapor o agua de enfriamiento. En el caso de fermentadores muy grandes el intercambio de calor a través de la cubierta es insuficiente de modo que hay que adaptar serpentines internos a través de los cuales se pasa vapor o agua de enfriamiento. En equipos a gran escala se necesita optimizar el sistema de aireación ya que la transferencia de oxígeno del gas al líquido es un proceso muy difícil porque el oxígeno es poco soluble en agua y un fermentador con una gran población microbiana tiene una tremenda demanda de oxígeno para el cultivo. Se necesitan dos dispositivos diferentes para asegurar la adecuada aireación: un dispositivo de aireación llamado difusor, y un dispositivo de agitación llamado impulsor. Para lograr una mezcla más eficiente se utilizan deflectores. El microbiólogo industrial debe conocer muy bien la extremadamente compleja dinámica de los fluidos en los fermentadores para diseñar y operar de un modo eficiente los mismos

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Fermentadores: a) de laboratorio; b) esquema de fermentador industrial; c) interior de un fermentador industrial.

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a) Conjunto de fermentadores pequeños para investigación usado en el desarrollo del proceso. b) Gran batería de fermentadores al aire libre (240 m3) que se utiliza para la fabricación de alcohol en Japón. Dada la gran diferencia de sus tamaños, la misma fermentación microbiana tendría que dirigirse en forma muy distinta en los dos tipos de fermentadores.

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Control y monitoreo del proceso Debido a los altos costos de producción, los fermentadores industriales están cuidadosamente controlados. No solo se controla el crecimiento y la producción del producto , sino que se deben controlar otros factores ambientales a medida que el proceso se efectúa. Los factores ambientales controlados más frecuentes son: la concentración de oxígeno, pH, masa celular, temperatura y concentración del producto. También hay que controlar la formación de espuma. En la actualidad se utilizan computadoras para controlar los procesos de fermentación ya sea en la obtención de datos o en el control de varios factores ambientales. La obtención de datos a medida que el proceso de fermentación tiene lugar se llama adquisición inmediata. Las computadoras también pueden graficar los datos obtenidos permitiendo al operador tener una representación visual del progreso de la fermentación. Las computadoras permiten también almacenar los datos para poder analizarlos. Las computadoras permiten un control inmediato del proceso a través de la modificación de los parámetros ambientales a medida que la fermentación progresa o agregando un nutriente a la velocidad de equilibrio exacto del crecimiento evitando que el mismo sea metabolizado a productos indeseables.

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Los procesos microbianos deben ser controlados en forma continua, usualmente esto se hace por medio de computadoras, a fin de asegurar rendimientos satisfactorios de los productos que se desean. a) Una gran planta de fermentación. Sólo se ve la parte superior de los fermentadores, que pueden tener una altura de varios pisos. b) Habitación de control por ordenador para una gran planta de fermentación

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Escalado de la fermentación Escalado o cambio de escala es la adaptación de un proceso industrial desde las condiciones de un pequeño laboratorio a las de una fermentación comercial a gran escala. La mezcla y la aireación son mucho mas eficientes en el matraz de laboratorio pequeño que en el fermentador industrial grande. A medida que cambia el tamaño del equipo, cambia la relación superficie/volumen. El fermentador tiene un volumen mucho mayor para un área superficial determinada. El escalado de la fermentación en el fermentador industrial es la tarea del ingeniero bioquímico, quien esta familiarizado con la transferencia de gases, la dinámica de fluidos y la termodinámica. El papel del microbiólogo industrial en el proceso de escalado es trabajar estrechamente con el ingeniero bioquímico para asegurar que se han abarcado los parámetros necesarios para una fermentación exitosa y que se dispone de las cepas microbianas apropiadas para una fermentación en gran escala.

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Las distintas etapas de escalado que deben realizarse para llegar de un proceso de laboratorio a un proceso industrial son las siguientes: 1- Experimentos en el matraz de laboratorio que son generalmente la primera indicación que es posible un proceso de interés industrial. 2- El fermentador de laboratorio, un fermentador a escala pequeña, generalmente de vidrio y de 5 a 10 litros de capacidad. En el fermentador de laboratorio es posible ensayar variaciones en el medio de crecimiento, temperatura, pH, etc., ya que los costos son bajos tanto en el equipo como en los medios de cultivo. 3- La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de 300 a 3000 litros. Aquí las condiciones se acercan mas a la escala industrial, pero el costo no es aun un factor de importancia. En el fermentador de una planta piloto es deseable una cuidadosa instrumentación y un control con computadora, de modo que las condiciones que se obtengan sean lo más similares a las del fermentador industrial. 4- El fermentador industrial mismo, generalmente de 10.000 a 400.000 litros

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En los estudios de escalado para los procesos aeróbicos, el parámetro de mayor importancia que se debe controlar durante el aumento de escala es la velocidad de transferencia de oxigeno; se debe mantener la tasa de oxigeno constante al incrementar las dimensiones del fermentador. La tasa de oxigeno expresa el consumo de oxigeno en mMoles de O2/l/hora que se requiere para obtener el optimo rendimiento.

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Esquema general de un proceso de fermentación a gran escala. El producto comercial esta usualmente en las células o en la fracción libre de células, pero no en ambas fracciones. De acuerdo a esto una de ambas fracciones debe ser posteriormente procesada (señalada con el símbolo “+”) o descartada (señalada con el símbolo “-”).

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Antibióticos: aislamiento y caracterización Los antibióticos son sustancias químicas producidas por los MOs que matan o inhiben el crecimiento de otros MOs. Los antibióticos son metabolitos secundarios típicos. Los que se usan comercialmente son producidos por hongos filamentosos y por bacterias del grupo de los actinomicetos. La mayoría se usa para el tratamiento de enfermedades bacteriana y algunos pocos son contra enfermedades fúngicas. Los géneros mas comunes son Streptomyces, Penicillum y Bacillus. Fabricar o producir comercialmente un antibiótico requiere además de un alto rendimiento, desarrollar un método eficiente de purificación. Por ejemplo si el antibiótico es soluble en un compuesto orgánico inmiscible en agua esto implica una purificación sencilla y de bajo costo por la facilidad de poder concentrarlo. Si el antibiótico no es soluble en algún disolvente, hay que separarlo por: a) adsorción; b) intercambio iónico; c) precipitación química. La meta es obtener un producto cristalino de elevada pureza. Para obtener cepas con altos rendimientos el químico debe obtener cepas que no produzcan impurezas indeseables o desarrollar métodos para eliminarlas.

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Aislamiento de antibióticos y método para probar el espectro de actividad antibiótico de un microorganismo La forma tradicional por la que se descubren nuevos antibióticos consiste en el rastreo (screening). Con este tipo de aproximaciones se aísla de la naturaleza, un gran número de posibles MOs productores de antibióticos (a). En estos aislamientos se ensaya la producción de antibióticos viendo si producen cualquier sustancia difusible que inhiba el crecimiento de ciertas bacterias representativas de patógenos bacterianos usadas como control en el test (b). Aquellos aislamientos que sean candidatos de la producción de antibióticos se estudian posteriormente, a fin de saber si los antibióticos que produce son nuevos o no. Cuando se descubre un MO que produce un nuevo antibiótico, éste se produce en cantidades suficientes para poder analizar su estructura y determinar luego su toxicidad y actividad terapéutica en animales infectados. La mayoría de los antibióticos nuevos fallan en el test en animales de experimentación. No obstante la búsqueda continúa ya que se estima que las especies del género Streptomyces producen unos 100.000 antibióticos diferente.

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Aislamiento de antibioticos Placa de agar Cultivo bacteriano

Hongo

Halo de inhibición

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Producción mundial anual y consumo de antibióticos. - Cada año se manufacturan más de 500 toneladas de agentes quimioterapéuticos. - Agente quimioterapéutico es todo compuesto químico que puede usarse por vía interna para controlar las enfermedades infecciosas. Son de gran utilidad en medicina clínica y veterinaria, así como en agricultura. - El elemento clave de todo agente quimioterapéutico es la toxicidad selectiva, es decir , la capacidad de inhibir a las bacterias u otros agentes patógenos sin afectar al hospedador. Se los puede agrupar en dos categorías generales, los agentes sintéticos y los antibióticos. Cefalosporinas inhiben la síntesis de la pared celular. Macrólidos ej. Eritromicina inhibe subunidad 50S (síntesis de proteínas). Quinolonas ej. Ácido nalidíxico interaccionan la DNA girasa. Penicilinas. Inhiben síntesis de pared Aminoglicósidos ej Estreptomicina inhibe subunidad 30S (síntesis de proteínas).

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Modo de acción de los principales quimioterapéuticos antimicrobianos

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Espectro de acción antimicrobiana de algunos agentes quimioterapéuticos seleccionados

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Producción industrial de la penicilina El anillo β-lactámico característico de las penicilinas se muestra en color marrón oscuro. Son producidas por varios hongos de los géneros Penicillum y Aspergillis y por algunos procariotas. La fermentación normal conduce a la producción de penicilinas naturales. Si durante la fermentación de añaden precursores específicos, se forman algunas penicilinas biosintéticas. Las penicilinas semisintéticas se producen añadiendo por métodos químicos una cadena lateral específica al núcleo del ácido 6-aminopenicilánico en la posición R. Las penicilinas semisintéticas son las que tienen la mayor utilidad clínica, puesto que por lo general son activas frente a bacterias Gram negativas y pueden istrarse por vía oral.

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Estructuras de algunas penicilinas importantes

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Cinética de fermentación de la penicilina con Penicillum chrysogenum. La producción de penicilina es un proceso aeróbico, se requiere una aireación muy eficiente. La penicilina es un metabolito secundario. Durante la fase de crecimiento se produce muy poca penicilina, pero una vez que se ha consumido la fuente de carbono casi completamente, empieza la fase de producción de la penicilina. Alimentando el fermentador con diversos componentes del medio de cultivo, se puede alargar por varios días la fase de producción. El licor de maíz es uno de los principales ingredientes de la mayoría de los medios de producción de penicilina. Esta sustancia contiene la fuente de nitrógeno y otros factores de crecimiento. La fuente de carbono es generalmente la lactosa. La penicilina se secreta al medio y una vez que las células se separan por filtración, se baja el pH del medio y se extrae el antibiótico con un disolvente orgánico. Después de concentrarse en el solvente, el antibiótico se vuelve a extraer en medio acuoso a pH alcalino, posteriormente se concentra y cristaliza. Por este método se puede obtener rápidamente penicilina con un alto nivel de pureza.

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Purificación de antibióticos

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Purificación de un antibiótico. Instalación para extraer un antibiótico del caldo de fermentación

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Esquema de la producción de clorotetraciclina con Streptomyces aureofaciens. En su biosíntesis están implicados más

de 72 productos intermediarios y los estudios genéticos han mostrado más de 300 genes involucrados en su síntesis. Si bien la regulación de este antibiótico es muy compleja, se sabe que la glucosa y el fosfato reprimen su síntesis. Se utiliza como materia prima el licor de maíz, como en el caso de la penicilina, pero la fuente de carbono es la sacarosa en lugar de la lactosa. Se evita el uso de glucosa porque causa una represión por catabolito en la producción del antibiótico.

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Vitaminas producidas por microorganismos a escala industrial a) Vitamina B12. Es una cobalamina. b) Vitamina B2 (Riboflavina) La mayoría de las vitaminas se sintetizan por métodos químicos, sin embargo algunas tienen una estructura muy complicada y se obtienen por procesos biocatalíticos como son la vitamina B12 y la Riboflavina. En el hombre, una deficiencia importante en la vitamina B12 produce la llamada anemia perniciosa, que se caracteriza por la baja producción de eritrocitos y alteraciones en el sistema nervioso. Los requerimientos de esta vitamina por los animales se realizan a través de la dieta o por la adsorción de la vitamina producida por los microorganismos que colonizan el intestino de los animales. Las plantas no producen ni utilizan vitamina B12. El rendimiento de esta vitamina se incrementa mucho utilizando cepas sobreproductoras del género Propionibacterium o Pseudomonas y añadiendo cobalto al medio de cultivo. La vitamina B2 importante y es Ashbya gossypii enormes de esta

o riboflavina es una coenzima muy sintetizada por muchos MOs. El hongo produce en forma natural cantidades vitamina (hasta 7g/l).

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Aminoácidos utilizados en la industria alimentaria

Los aminoácidos tienen muchos usos en la industria alimentaria, en medicina y como precursores de la industria química. El más importante comercialmente es el ácido glutámico, que se utiliza para aumentar el sabor. Otros aminoácidos importantes son el ácido aspártico y la fenilalanina, que son los ingredientes del edulcorante artificial aspartame, un ingrediente en las bebidas bajas en calorías y en otros productos sin azúcar.

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Si bien la mayor parte de los aminoácidos se puede producir por síntesis química, esta última da como resultado las formas L y D. Si se necesita la forma L, bioquímicamente importante, entonces es necesario aplicar un método de fabricación enzimático o microbiológico. La producción microbiológica de los aminoácidos puede hacerse por fermentación directa, en la cual un microorganismo produce el aminoácido en un proceso estándar de fermentación, o mediante síntesis enzimática, donde el microorganismo es la fuente de una enzima y entonces se utiliza ésta en el proceso de producción. Regulación de la biosíntesis de aminoácidos La síntesis de los aminoácidos se lleva a cabo a través de una serie de etapas en las que intervienen distintas enzimas a partir de precursores de la vía glucolítica o del ciclo del ácido tricarboxílico y su regulación se efectúa por retroalimentación, es decir que la primera etapa enzimática, única para una vía biosintética de un determinado aminoácido suele estar sometida a inhibición por retroalimentación por el producto final de esa vía. Así al aumentar la concentración de un determinado aminoácido, se inhibe la actividad de la enzima que conduce a la biosíntesis de ese aminoácido, dando como resultado una reducción en la síntesis. Una forma de lograr la sobreproducción de un determinado aminoácido es obtener una mutante en la primera y única enzima de esa vía de síntesis del aminoácido, de forma tal que ya no esté sometida a la inhibición por retroalimentación.

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Inhibición de la actividad enzimática por retroalimentación La inhibición por retroalimentación se observa principalmente en la regulación de las rutas biosintéticas complejas, tales como las rutas implicadas en la síntesis de un aminoácido o de una purina. Tales rutas requieren muchas etapas enzimáticas y el producto final, aminoácido o nucleótido, está separado del sustrato inicial por muchas etapas. Aún así el producto final es capaz de retroalimentar la primera etapa de la ruta y regular su propia biosíntesis. En la inhibición por retroalimentación, el aminoácido u otro producto final de la ruta biosintética inhibe la actividad de la primera enzima de esta ruta. Esto se debe a una propiedad de la enzima inhibida conocida como alosterismo. Una enzima alostérica tiene dos sitios de unión importantes, el sitio activo, donde se une el sustrato , y el sitio alostérico, donde se une reversiblemente el inhibidor, llamado a veces efector. Cuando un inhibidor se une, por lo general no covalentemente, al sitio alostérico, la conformación de la molécula de enzima cambia, de manera que el sustrato deja de unirse eficientemente al sitio activo.

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Mecanismo de inhibición enzimática por un efector alostérico

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Producción de la lisina utilizando Brevibacterium flavum. La lisina es un aminoácido esencial para el hombre y es utilizada como aditivo alimentario. Se produce comercialmente utilizando la bacteria Brevibacterium flavum. La síntesis de lisina, como la de otros aminoácidos se encuentra estrictamente regulada. Para poder obtener los aminoácidos en forma económica es necesario obtener cepas sobreproductoras, es decir que no sufran el fenómeno general de inhibición por retroalimentación. En la vía bioquímica que conduce desde el aspartato a la lisina, esta última puede inhibir por retroalimentación la actividad de la enzima aspartatoquinasa. La sobreproducción de lisina puede obtenerse aislando mutantes en las cuales la aspartatoquinasa no esté sujeta a retroinhibición. Esto se logra aislando mutantes resistentes a un análogo de la lisina, la Saminoetilcisteína (AEC), que se une al sitio alostérico de la enzima e inhibe su actividad. Las mutantes resistentes a la AEC que se obtienen fácilmente por selección positiva, producen una modificación de la aspartatoquinasa con un sitio alostérico alterado que ya no reconoce la AEC o a la lisina, por lo que la retroinhibición por lisina está muy reducida. Dichas mutantes pueden producir hasta 60 g de lisina por litro en fermentadores industriales.

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Producción de ácido glutámico Un factor muy importante para lograr un proceso de producción comercial de un aminoácido es conseguir la excreción del mismo al medio de cultivo. En general, los organismos no excretan los metabolitos indispensables como los aminoácidos. Aumentando la excreción se evitarían concentraciones relativamente altas dentro de la célula, que podrían ocasionar inhibición por retroalimentación, aún en mutantes resistentes. Una forma de obtener un nivel elevado de excreción de un aminoácido es el que se utiliza en la obtención del ácido glutámico. La producción y excreción del ácido glutámico depende de la permeabilidad celular. El organismo productor del ácido glutámico, Corynebacterium glutamicum, requiere la vitamina biotina, factor indispensable en la biosíntesis de los ácidos grasos. La deficiencia en biotina daña la membrana celular como resultado de una producción deficiente de fosfolípidos y bajo estas condiciones se excreta el ácido glutámico intracelular. El medio empleado para la producción del ácido glutámico contiene en una primera etapa suficiente biotina para obtener un buen desarrollo del microoganismo y en una segunda etapa la deficiencia de biotina asegura la excreción de ácido glutámico al medio. El descubrimiento del papel de la deficiencia en biotina en la producción del ácido glutámico ha permitido el desarrollo de métodos racionales para la formulación de un medio para producir este aminoácido.

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Bioconversión microbiana Los microorganismos pueden usarse para biocatalizar reacciones químicas específicas. Este proceso se denomina bioconversión o biotransformación, e implica el cultivo del MO en fermentadores grandes, seguido de la adición del compuesto químico que ha de ser convertido, en el momento adecuado. Después de un período de incubación, durante el cual el MO actúa sobre el compuesto químico, se extrae el caldo de fermentación y se purifica el producto que se desee. Si bien la bioconversión puede usarse para varios procesos, su principal utilización industrial ha sido la producción de algunas hormonas esteroideas. Producción de cortisona utilizando Rhizopus nigricans

Solo la primera reacción es una bioconversión microbiana típica. Esta oxidación altamente específica es realizada por el hongo Rhizopus nigricans y omite una difícil reacción química. Todos los otros pasos se realizan químicamente.

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Enzimas Las enzimas extracelulares (exoenzimas) se secretan al medio de cultivo y son capaces de digerir polímeros insolubles como la celulosa, las proteínas y el almidón; posteriormente, los productos de digestión son transportados al interior de las células donde se utilizan como nutrientes para el crecimiento. Algunas de estas exoenzimas se utilizan en las industrias alimentaria, láctica, farmacéutica y textil, y se producen en grandes cantidades por síntesis microbiana. Las enzimas son biocatalizadores especialmente útiles porque a menudo actúan en grupos funcionales químicos que son únicos, distinguen fácilmente entre grupos funcionales similares de una misma molécula y, en muchos casos, catalizan reacciones de una forma estereoespecífica, produciendo sólo uno de los dos posibles enantiómeros (por ejemplo, el enantiómero-D de un azúcar , o un L-aminoácido.

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Proteasas, amilasas y jarabes ricos en fructosa

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Las enzimas que más se producen comercialmente son las proteasas, que se usan como aditivos en los detergentes para lavar la ropa. La mayoría de los detergentes que se utilizan actualmente contienen proteasas, amilasas, lipasas, reductasas y otras enzimas. Muchas de estas enzimas se aíslan de bacterias alcalófilas del género Bacillus. Otras enzimas importantes fabricadas comercialmente son las amilasas y glucoamilasas, que se emplean en la producción de glucosa a partir de almidón. La glucosa se convierte luego en fructosa (que es más dulce que la glucosa y la sacarosa) por acción de la enzima glucosa isomerasa. Este proceso lleva a la obtención de un edulcorante rico en fructosa a partir de almidón de maíz, trigo o papa.

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En la conversión del almidón de maíz en el producto llamado jarabe de maíz rico en fructosa funcionan tres reacciones en secuencia, cada una de ellas catalizada por una enzima microbiana diferente. 1- La enzima alfa-amilasa lleva a cabo el ataque inicial sobre el polisacárido almidón, acortando la cadena y reduciendo la viscosidad del polímero. Esta se llama reacción de adelgazamiento. 2-La enzima glucoamilasa produce monómeros de glucosa a partir de los polisacáridos acortados, proceso llamado sacarificación. 3- La enzima glucosa isomerasa lleva a cabo la conversión final de la glucosa en fructosa, proceso que recibe el nombre de isomerización. Las tres enzimas se producen por fermentación microbiana. El producto final de esta serie de reacciones es un jarabe que contiene cantidades aproximadamente iguales de glucosa y fructosa, el cual se puede adicionar directamente a bebidas refrescantes y a otros productos alimenticios. Esto permitió a Estados Unidos usar el almidón de maíz en lugar de importar la sacarosa y ahorrar millones de dólares por años.

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Enzimas microbianas y sus aplicaciones

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Extremoenzimas: enzimas de procariotas que viven en ambientes extremos. Algunos procariotas llamados hipertermófilos, tienen un crecimiento óptimo a temperaturas muy altas y producen proteínas termoestables que funcionan a altas temperaturas. El término extremoenzimas se refiere a enzimas que funcionan en condiciones muy altas o muy bajas de temperatura, pH, salinidad, etc. Los organismos que las producen se denominan extremófilos.

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Enzimas inmovilizadas En algunos procesos biocatalíticos se desea convertir enzimas solubles en enzimas inmovilizadas. La inmovilización no solo facilita la reacción enzimática en condiciones de producción continua a gran escala, sino que también contribuye a la estabilización de las enzimas evitando su desnaturalización. Existen tres aproximaciones básicas para la inmovilización de enzimas. 1- Polimerización (entrecruzamiento, cross-linkage) de las moléculas de enzima. El enlace de unas moléculas de enzima con otras se hace a través de una reacción química con un agente bifuncional de entrecruzamiento como el glutaraldehido. 2- Unión de la enzima a un soporte. La unión puede hacerse por adsorción, enlace iónico, o enlace covalente. Los soportes usados son celulosas modificadas, carbón activado, arcillas minerales, óxido de aluminio y bolitas de vidrio. 3- Inclusión enzimática, que comprende la inclusión de la enzima en una membrana semipermeable. Las enzimas pueden encerrarse en microcápsulas, geles, membranas semipermeables de polímeros, o polímeros fibrosos como el acetato de celulosa. Cada uno de estos métodos tiene ventajas y desventajas y el procedimiento utilizado depende de la enzima y de la aplicación industrial particular.

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Células inmovilizadas • • • • •

En algunos casos no es necesario utilizar la enzima purificada. Se pueden utilizar células inmovilizadas para utilizarlas en procesos industriales. En general se utilizan para procesos de flujo continuo. Se utilizan instalaciones mucho mas económicas. Un ejemplo es la utilización de células de Bacillus cuagulans inmovilizadas para la conversión continua de jarabe de glucosa en jarabe de fructosa. Este microorganismo es productor de glucosa isomerasa, la enzima que convierte la glucosa en fructosa.

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Producción de productos de mamíferos por microorganismos modificados por ingeniería genética.

El mayor interés esta en la producción de proteínas y de péptidos de mamíferos por medios microbianos, ya que muchos de estos compuestos tienen un alto valor farmacéutico, son costosos y difíciles de obtener por otros métodos. A pesar de la excitante promesa de la ingeniería genética en la biotecnología, lograr la comercialización de un producto es una empresa gigantesca. Además de la correcta clonación y expresión del gen de interés en una bacteria o levadura, y de la purificación del producto deseado, se deben tomar en consideración otros aspectos como las pruebas clínicas y permisos gubernamentales. Cualquier producto sintetizado microbiológicamente, que se intente utilizar en el hombre, debe pasar pruebas clínicas exhaustivas. Por ej., la insulina producida microbiológicamente mediante la tecnología del DNA recombinante ha tenido que pasar pruebas clínicas estrictas con voluntarios humanos, a pesar de que se ha demostrado que la insulina producida microbiológicamente es idéntica a la proteína fabricada por humanos. Si todo va bien en las pruebas clínicas, se puede pedir el permiso oficial, pero esto puede ser un proceso que consume mucho tiempo.

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Ejemplos de productos biotecnológicos importantes, fabricados por medio de DNA recombinante.

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Producción de insulina La insulina es un hormona. Es una proteína pancreática que regula el metabolismo de los carbohidratos en mamíferos. La diabetes es una enfermedad caracterizada por una insuficiencia de insulina y afecta a millones de personas. El tratamiento estándar consiste en la istración de ésta hormona periódicamente en forma oral o inyectable. La hormona proveniente de páncreas de terneros o de cerdos no resulta tan eficaz como la insulina humana y , además, el proceso de aislamiento es caro y complejo. Por esta razón se ha llevado a cabo la clonación del “gen” de la insulina humana en bacterias. La insulina humana consta de dos polipéptidos (A y B) conectados por puentes disulfuro. Estos dos péptidos están codificados por partes separadas del mismo gen de la insulina. El gen de la insulina codifica la preproinsulina, un péptido más largo que contiene una secuencia señal (implicada en la secreción de la proteína), los polipéptidos A y B de la molécula de insulina activa, y un polipéptido de unión que está ausente en la insulina madura. La proinsulina se forma a partir de la preproinsulina, y la conversión de proinsulina en insulina implica la ruptura enzimática del polipéptido de unión entre las cadenas A y B.

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Procesamiento de la preproinsulina

La metionina inicial es eliminada de la cadena antes de que se sintetice la molécula completa de preproinsulina. Tras la eliminación del péptido líder, la molécula de insulina se pliega y el péptido C se elimina originando las cadenas A y B de la insulina. Estas cadenas quedan unidas por puentes disulfuro.

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Hasta el momento se han utilizado dos métodos para la producción de insulina humana en bacterias: (1) producción de proinsulina y conversión en insulina mediante métodos químicos, y (2) producción de las cadenas A y B en dos cultivos bacterianos separados, así como unión de las dos cadenas mediante procedimientos químicos para producir la insulina. Para sintetizar insulina, la secuencia de DNA adecuada se realizó en forma química. La cadena A consta de 63 bases y la cadena B de 90 bases. En la proinsulina existen otras 105 bases adicionales que codifican el péptido C que conecta las cadenas A y B. Se añadieron bases en los extremos para el corte con enzimas de restricción adecuadas que permitieran clonar los fragmentos dentro de un plásmido vector. Para obtener una expresión eficaz, los genes se insertaron debajo de un promotor adecuado de Escherichia coli, pero de manera que el fragmento de insulina se sintetizara como parte de una proteína de fusión para que fuera más estable. Se colocó también un triplete que codifica para metionina en el punto que unía el gen de la insulina con la parte superior del gen de fusión para poder cortar luego el producto formado con bromuro de cianógeno aprovechando la propiedad de que la insulina no tiene residuos metionina en su molécula y el bromuro de cianógeno corta específicamente por los residuos metionina.

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Cuando se utiliza el método de la proinsulina, la proinsulina aislada de las bacterias por el tratamiento con bromuro de cianógeno, se convierte en insulina cuando se forma el enlace disulfuro y se produce la eliminación enzimática del péptido de unión el cual se hace por tratamiento con las proteasas tripsina y carboxipeptidasa B, que no tienen efecto sobre la molécula de insulina. Cuando la insulina se produce mediante los péptidos separados A y B, cada uno de los péptidos se aíslan de un cultivo independiente y las cadenas se separan mediante el corte con bromuro de cianógeno. Las cadenas cortas se conectan luego mediante un tratamiento químico que permite la formación de los puentes disulfuro. En los dos casos el producto final es idéntico a la proteína purificada del páncreas humano y los costos son menores que los requeridos para la purificación de la insulina de cerdos o de terneros.

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Ingeniería genética para la producción de insulina humana en bacterias

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Ingeniería genética aplicada a la producción de xantano Xantomonas campestris es una bacteria Gram negativa del suelo aeróbica obligada que produce el biopolímero xantano de importante valor comercial. Es un exopolisacárido que se produce como un subproducto del metabolismo secundario. El xantano tiene un alto PM y esta compuesto por un esqueleto de celulosa (glucosa-β1,4-glucosa) que tiene el trisacárido manosa-ácido glucurónico-manosa como rama lateral en forma alternada sobre dicho esqueleto. Posee además los sustituyentes acetato y piruvato sobre la primera y tercera manosa lateral.

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El xantano tiene una viscosidad alta, es estable en ambientes físicos y químicos extremos y tiene propiedades similares a las de un plástico. En particular las propiedades físicas lo hacen útil como estabilizante, emulsionante, adelgazante o agente para suspender otros compuestos. Para la obtención exitosa del xantano en forma comercial se deben bajar los costos para lo cual se debe disponer de una fuente de carbono de costo bajo o nulo. Xanthomonas campestris puede utilizar en forma eficiente glucosa, sacarosa y almidón, pero no puede usar lactosa como fuente de carbono. El suero es un subproducto de la manufactura de los quesos. Este consta de 94% a 95% de agua, 3,4 a 4% de lactosa, pequeñas cantidades de proteínas, minerales y compuestos orgánicos de pajo PM. Diariamente se producen enormes cantidades de suero por la industria y son un problema importante. La liberación de este suero a ríos o lagos puede disminuir la cantidad de O2 disponible y por ende matar a muchos organismos acuáticos. El transporte de estos sueros a distintos sitios para su degradación puede ser extremadamente costoso y puede ser una fuente potencial de contaminación subterránea. Por otra parte los costos para remover los componentes sólidos del suero son prohibitivos. En consecuencia, se han desarrollado muchos esquemas para deshacerse de los sueros en forma creativa. Teóricamente el suero puede ser usado como fuente de carbono para el crecimiento industrial de microorganismos importantes.

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Con esto en mente X. campestris fue modificado genéticamente para crecer sobre suero. Los genes lacZY de Escherichia coli, los cuales codifican para la β-galactosidasa y la lactosa permeasa fueron clonados en un plásmido de amplio rango de huésped bajo el control transcripcional de un promotor de un bacteriófago de X. campestris. Esta construcción fue introducida en E. coli y luego transferida de E. coli a X. campestris por conjugación triparental. Los transformantes que mantuvieron el plásmido y que expresaron niveles altos de β-galactosidasa y de lactosa permeasa, utilizan la lactosa como fuente de carbono y produjeron altos niveles de xantano usando como fuente de carbono glucosa, lactosa o suero.

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Tipos de fermentadores El objetivo de la biotecnología es obtener productos metabólicos útiles a partir de materiales biológicos. La biotecnología comprende dos fases distintas: la fermentación y la recuperación de los productos. Procedimientos de fermentación consisten en: 1- el desarrollo de cepas mediante manipulación genética y/o la regulación del metabolismo 2- la optimización del medio de cultivo 3- el control adecuado de los factores físico-químicos que afectan al rendimiento de las fermentaciones industriales (02, Tª, pH, etc.). Recuperación del producto o "procesamiento posterior" (del inglés downstream processing) consiste en: 1- la extracción de los productos 2- la purificación de los productos biológicos

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Cambio de escala •

Las condiciones para obtener los mejores rendimientos a gran escala no son en general las mismas que las encontradas en pequeña escala. Ej. Un cultivo de 200 ml en un erlenmeyer requieren un motor de 300 w para agitarlo; entonces un cultivo de 10.000 litros requerirían un agitador con un motor de 15 megawatios. Esto no es cierto ya que el motor sería tan grande como una casa y el calor generado herviría a los microorganismos.

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Proceso típico de fermentación • • • • • • •

Formulación y esterilización del medio de cultivo. Esterilización del equipamiento. Crecimiento del cultivo de mantenimiento (5 a 10 ml). Crecimiento posterior en un matráz de laboratorio ( 200 a 1000 ml) Prefermentador (10 a 100 litros) Fermentador de producción (1.000 a 100.000 litros). Al terminar la fermentación las células se separan del cultivo líquido.

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Si el producto es intracelular, las células se rompen, se recupera el producto del fluido celular libre de restos celulares. Si el producto es extracelular, se purifica del sobrenadante libre de células.

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Criterios mas importantes para el diseño de un fermentador 1.- El tanque debe diseñarse para que funcione asépticamente durante numerosos días, así como para las operaciones de más larga duración. 2.- Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireación y agitación para cubrir las necesidades metabólicas de los microorganismos. 3.- El consumo de energía debe ser tan bajo como sea posible. 4.- Debe tener un sistema para el control del pH. 5.- El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras. 6.- Debe existir un sistema para el control de la temperatura. 7.- Las pérdidas por evaporación no deben ser excesivas. 8.- El diseño del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante el funcionamiento, recolección, limpieza y mantenimiento sean mínimas. 9.- El tanque debe ser versátil para la aplicación de diversas modalidades de procesos.

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10.- Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde sea posible, soldaduras. 11.- La geometría del fermentador debe ser similar a otros tanques más pequeños o mayores de la planta o a los de la planta piloto para poder reproducir procesos a diferentes escalas. 12.- deben emplearse los materiales más baratos que proporcionen resultados satisfactorios. 13.- Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador.

• •

De los 13 puntos mencionados anteriormente, los dos puntos de mayor relevancia que hay que considerar son probablemente: 1- El mantenimiento de un ambiente aséptico. 2- Las condiciones aeróbicas adecuadas. Los fermentadores más ampliamente utilizados a nivel industrial están provistos de mecanismos de agitación, dispersión y aireación así como de sistemas para el control de la temperatura, pH y formación de espuma.

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Tipos de fermentaciones 1.- Fermentación discontinua 2.- Fermentación alimentada (fed-batch) 3.- Fermentación continua 4.- Reactores de enzimas o células inmovilizadas

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1.- Fermentación discontinua •

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•

Una fermentación discontinua (en batch) puede ser considerada como un "sistema cerrado". Al inicio de la operación se añade la solución esterilizada de nutrientes y se inocula con el microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubación en condiciones óptimas de fermentación. A lo largo de toda la fermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de aire), un agente antiespumante y ácidos o bases para controlar el pH. La composición del medio de cultivo, la concentración de la biomasa y la concentración de metabolitos cambia generalmente como resultado del metabolismo de las células observándose las cuatro fases típicas de crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte. En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe al final de la fase logarítmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de muerte (metabolitos secundarios).

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2.- Fermentación alimentada (fed-batch) •

En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de describir, todos los sustratos se añaden al principio de la fermentación. Una mejora del proceso cerrado discontinuo es la fermentación alimentada que se utiliza en la producción de sustancias como la penicilina. En los procesos alimentados, los sustratos se añaden escalonadamente a medida que progresa la fermentación. La formación de muchos metabolitos secundarios está sometida a represión catabólica (efecto glucosa). Por esta razón en el método alimentado los elementos críticos de la solución de nutrientes se añaden en pequeñas concentraciones al principio de la fermentación y continúan añadiéndose a pequeñas dosis durante la fase de producción.

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3.- Fermentación continua •

En la fermentación continua se establece un sistema abierto. La solución nutritiva estéril se añade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solución utilizada de los nutrientes, con los microorganismos, se saca simultáneamente del sistema.

4.- Reactores de enzimas o células inmovilizadas Consiste en pasar el medio fresco a través de un biorreactor en el que por diversas técnicas hemos inmovilizado células (o enzimas). En el biorreactor se producen las transformaciones bioquímicas que deseamos y recuperamos el producto transformado tras su paso por la columna. Con este sistema se eliminan los problemas de desequilibrio (estabilidad) del sistema continuo clásico y además el producto resultante está libre de células. Presenta el inconveniente de que no todos los microorganismos pueden inmovilizarse.

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Reactores de enzimas o células inmovilizadas •

Existen tres métodos de inmovilizar las células: a.- Asociación física mediante resinas de intercambio iónico. La unión se puede romper fácilmente. b.- Unión covalente mediante glutaraldehido, tolueno, di-isocianato, iodo acetil celulosa. Unión fuerte aunque inactivación. c.- Atrapamiento mediante colágeno, gelatina, agar, alginatos, poliacrilamida, poliestireno. Es el método más utilizado en inmovilización de células; para ello se mezclan las células con el polisacárido líquido y posteriormente se deja enfriar para que solidifique. Finalmente se fragmenta o granula y se empaqueta en una columna.

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Objetivo fundamental de la industria de las fermentaciones: 1- minimizar costos 2- incrementar los rendimientos. Este objetivo puede alcanzarse si se desarrolla el tipo de fermentación más adecuado para cada paso en particular. El coste de producción de biomasa mediante cultivo continuo es potencialmente inferior al de cultivo discontinuo, sin embargo, no se utilizan de forma general en la industria debido fundamentalmente al mayor nivel de experiencia que se tiene en el crecimiento de células en fermentación discontinua.

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Limitaciones prácticas de los procesos continuos para la fabricación de metabolitos Aunque muchas fermentaciones para la producción de metabolitos funcionan bien como procesos continuos, sólo unos pocos procesos han resultado útiles para la aplicación práctica por varias razones: a.- Muchos métodos de laboratorio operan continuamente durante solamente 20 a 200 horas; para que sea de utilidad industrial el sistema debe ser estable durante al menos 500 a 1.000 horas. b.- Mantener las condiciones estériles a escala industrial a lo largo de un período de tiempo prolongado es difícil.

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c.- La composición de los sustratos debe ser constante a fin de obtener una producción máxima. La composición de las soluciones de nutrientes industriales son variables (líquido de maceración del maíz, peptona, etc.) lo que puede originar cambios en la fisiología de la célula y disminuir la productividad. d.- Cuando se utilizan cepas de alto rendimiento se producen mutantes degenerados, los cuales pueden crecer en cultivo continuo más deprisa que las cepas de producción por lo que el rendimiento disminuye con el tiempo ya que cada vez son menos células las que sintetizan el producto de interés.

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FACTORES FISICO-QUIMICOS QUE AFECTAN AL RENDIMIENTO DE LAS FERMENTACIONES INDUSTRIALES

• 1.- Oxígeno • 2.- Temperatura • 3.- pH 1. Oxígeno: El suministro de O2 es uno de los factores más críticos en la operación de fermentación a gran escala. - El oxígeno es el sustrato gaseoso más importante para el metabolismo microbiano y el anhídrido carbónico es el producto metabólico más importante. - El oxígeno no es un gas muy soluble ya que, cuando se utiliza aire, una solución saturada de oxígeno en agua contiene aproximadamente 9 mg /litro y 43 mg/litro cuando se utiliza oxigeno puro. A medida que aumenta la temperatura disminuye la solubilidad del O2 -El suministro de O2 se logra pulverizando aire en el fermentador durante el proceso.

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2.- Temperatura. Es otro parámetro importante.

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Si la temperatura es inferior a la óptima, hay un crecimiento retardado y menor productividad. Si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una respuesta de estrés al choque térmico con la consiguiente producción de proteasas celulares que ocasionan una disminución en el rendimiento de los productos proteicos. A fin de obtener rendimientos óptimos, las fermentaciones deben ser llevadas a cabo en un margen estrecho de temperatura y en lo posible constante. La velocidad de producción de calor debida a la agitación y a la actividad metabólica de los microorganismos no se ve compensada por las pérdidas de calor que resultan de la evaporación, por lo que se debe recurrir a sistemas de refrigeración. Los mas usados son las camisas de agua.

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• 3.- pH La mayor parte de los microorganismos crecen óptimamente entre pH 5,5 y 8,5. Pero durante el crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares son liberados al medio, lo que puede originar un cambio del pH del medio de cultivo. Por lo tanto se debe controlar el pH del medio de cultivo y añadir un ácido o una base cuando se necesite para mantener constante el pH. Por supuesto que esta adición del ácido o base debe ser mezclada rápidamente de tal manera que el pH del medio de cultivo sea el mismo en todo el fermentador.

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AGITACION Y MEZCLADO •

La agitación es la operación que crea o que acelera el o entre dos o varias fases. Una fermentación microbiana puede ser considerada como un sistema de tres fases, que implica reacciones líquido-sólido, gas-sólido y gas-líquido. 1.- La fase líquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos. Puede existir, en algunos casos, una segunda fase líquida si existe un sustrato inmiscible en agua como por ejemplo los alcanos. 2.- La fase sólida consiste en células individuales, bolitas de micelio, sustratos insolubles o productos del metabolismo que precipitan. 3.- La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de oxígeno, para la eliminación del CO2 o para el ajuste del pH con amonio gaseoso.

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Una adecuada agitación de un cultivo microbiano es esencial para la fermentación ya que produce los siguientes efectos en las tres fases: 1.- Dispersión del aire en la solución de nutrientes. 2.- Homogeneización, para igualar la temperatura, pH y concentración de nutrientes, en el fermentador. 3.- Suspensión de los microorganismos y de los nutrientes sólidos. 4.- Dispersión de los líquidos inmiscibles.

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Bajo estas premisas se podría concluir que cuanto mayor sea la agitación, mejor será el crecimiento. Sin embargo, la agitación excesiva puede romper las células grandes e incrementar la temperatura lo que ocasiona un descenso en la viabilidad celular. Por lo tanto, se debe conseguir un balance entre la necesidad del mezclado y la necesidad de evitar el daño celular.

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Los diferentes tipos de agitación que se utilizan en las fermentaciones se incluyen dentro de las siguientes clases: 1.- Agitadores rotativos, los cuales tienen un sistema interno mecánico de agitación. 2.- Columnas de burbujas, la agitación se realiza mediante la introducción de aire a sobrepresión. 3.- Sistema aero-elevado (airlift), que pueden tener un circuito interno o externo. La mezcla y circulación de los fluidos son el resultado de las corrientes de aire introducido, las cuales causan diferencias en la densidad dentro de las diferentes partes del fermentador. De estos tres tipos el más utilizado es el primero ya que es más flexible en las condiciones de operación, es más fácil de conseguir comercialmente, provee una eficiente transferencia de gases a las células y es el tipo con el que se tiene más experiencia.

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Esterilización industrial Es imprescindible y obligatorio tener en todas las etapas cultivos libres de contaminantes, desde el cultivo preliminar hasta el fermentador de producción. Hay que esterilizar: 1- El fermentador 2- Todo el equipamiento (uniones, válvulas, electrodos) 3- Medio de cultivo 4- Aditivos (antiespumantes) - No es necesario esterilizar los ácidos y bases concentrados - No deben existir roturas mecánicas en el fermentador que podrían permitir la entrada de microorganismos.

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Bioreactor Se puede esterilizar con: 1- Calor 2- Radiación 3- Producto químico 4- Separando los organismos viables mediante un procedimiento físico como la filtración. Durante la fermentación se deben observar dos puntos para asegurar la esterilidad: - Esterilidad en el medio de cultivo - Esterilidad del aire que entra y sale

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ESTERILIZACION DEL MEDIO DE CULTIVO • •

Por calor. Por filtración. Esterilización por calor El exito de la esterilización por calor depende de: 1- el número y tipo de microorganismos presentes 2- la composición del medio de cultivo 3- el valor del pH 4- el tamaño de las partículas en suspensión. Las células vegetativas son eliminadas rápidamente a temperaturas relativamente bajas, pero para la destrucción de las esporas se necesitan temperaturas de 121°C. Esterilización por filtración Se utiliza frecuentemente para todos los componentes de la solución de nutrientes que son sensibles al calor (vitaminas, antibióticos, componentes de la sangre, etc).

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A- Esterilización discontínua de los medios - Esterilización Indirecta: consiste en inyectar vapor en la camisa del fermentador o en los serpentines interiores. - Procedimiento directo: consiste en inyectar vapor en la propia solución de nutrientes. Pre-requisito, tener vapor puro (libre de aditivos químicos). Inconvenientes del proceso de esterilización discontinua - Se requieren tiempos largos para alcanzar y mantener la temperatura de 121oC. - Es un procedimiento muy costoso, si el agua caliente que se produce durante el enfriamiento posterior del reactor no se aplica a algún uso. - Las fases de calentamiento, esterilización y enfriamiento no solamente matan a los microorganismos, sino que también alteran severamente la solución de nutrientes (caramelización, deterioro de la calidad del medio, destrucción de vitaminas, cambio de pH).

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B.- Esterilización continua - La esterilización continua es la etapa preliminar lógica en una fermentación continua a escala industrial - Para obtener posibles mayores rendimientos en el tiempo y el espacio asignados se puede utilizar en la fermentación discontinua - Mientras la esterilización discontinua se lleva a cabo en 30-60 minutos a 121° C, la esterilización continua se lleva a cabo normalmente en 30-120 segundos a 140° C. - El calentamiento del medio de cultivo para la esterilización continua puede ser llevado a cabo mediante inyección de vapor o mediante intercambiadores de calor.

Inconveniente en el proceso de esterilización contínua - Cuando se usa el método de intercambiadores de calor se pueden formar sales insolubles (p. ej. fosfato cálcico u oxalato cálcico) con algunas soluciones de nutrientes. - Las soluciones que contienen almidón, que se hacen viscosas cuando se calientan, son difíciles de utilizar en procesos de esterilización continua. - El tiempo de esterilización puede ser insuficiente si hay partículas insolubles en el medio.

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ESTERILIZACION DEL AIRE DE FERMENTACION • •

El aire que se suministra al fermentador debe ser esterilizado. El número de partículas y microorganismos en el aire varía en gran medida dependiendo de la localización de la planta, el movimiento del aire y el tratamiento previo del aire. Métodos existentes para la esterilización de los gases: 1-filtración 2- inyección de gas (ozono), 3- depuración de gas 4- radiación (UV) 5- calor Solamente el calor y la filtración fueron utilizados industrialmente. A partir de la crisis del petróleo de los años 70, el proceso de esterilización por calentamiento eléctrico ha sido reemplazado por la filtración.

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Esterilización del aire por filtración - En los sistemas industriales actuales el aire se esteriliza por filtración a través de filtros de cartuchos que poseen una estructura membranosa plegada (ésteres de celulosa, polisulfona o nylon). - En la actualidad no existen filtros industriales absolutos para bacteriófagos. - Los bacteriófagos pueden ocasionar el fallo total de un sistema como por ejemplo en la producción de ácido glutámico por Corynebacterium glutamicum o al trabajar con Escherichia coli. - El aire que sale del fermentador también debe ser esterilizado, sobre todo si se trabaja con organismos recombinantes. No sólo como medida de

seguridad, sino también para prevenir que las cepas industriales se liberen al medio ambiente y por lo tanto estén disponibles de una forma gratuita para los competidores.

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I. PREPARACION Y PROPAGACION DE INOCULOS - El tamaño del inóculo generalmente es del orden del 1-10% del volumen total del medio. Si es inferior a esta proporción puede existir un período de latencia excesivamente prolongado, lo que prolongará el período de fermentación. El proceso de fermentación se lleva a cabo en cuatro etapas: I. Preservación del inóculo II. Multiplicación del inóculo III. Cultivo de prefermentación IV. Fermentación de producción

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Etapa I: Preservación del inóculo • •

• • • • •

Debe preservarse no solo la supervivencia de las cepas sinó la capacidad de formar el producto de interés a lo largo de un período de tiempo largo. Durante el proceso de selección de cepas, las cepas superproductoras están frecuentemente dañadas en su metabolismo primario y frecuentemente degeneran durante las sucesivas transferencias, probablemente como resultado de mutaciones espontáneas (revertantes). El objetivo de la preservación es mantener las cepas durante tanto tiempo como sea posible sin división celular. Las cepas maestras no deberían ser cultivadas más que una vez cada dos años controlando los niveles de actividad con cada uso Dependiendo de la cepa, deben ser llevados a cabo periódicamente programas de selección. Las cepas de trabajo derivan de las cepas maestras. Las cepas de trabajo deben ser inspeccionadas en relación a su pureza y su capacidad de formar producto para posteriormente ser almacenadas hasta su uso.

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Etapa II: Crecimiento del inóculo • El cultivo preservado se reaviva inicialmente mediante crecimiento en un cultivo líquido en agitación o en medio sólido si se requiere la formación de esporas. • Las condiciones utilizadas en el cultivo inicial (composición del medio, temperatura de incubación, etc.) dependerán del proceso específico.

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Etapa III: Precultivo en fermentador •

• •

A fin de obtener suficiente inóculo para el fermentador de producción, deben realizarse precultivos en fermentadores más pequeños. Si un fermentador de producción se inicia con demasiado poco inóculo, el crecimiento se retrasa y la velocidad de formación del producto puede ser insatisfactoria. La concentración óptima del inóculo para el fermentador de producción determina el número de etapas del precultivo de fermentación que son necesarias. En general se requieren las siguientes concentraciones de inóculo: Actinomicetos...........5 - 10 % Otras Bacterias..........0,1 - 3,0 % Hongos..................5 - 10 % A veces el medio de cultivo de producción se utiliza en la última etapa de formación del inóculo a fin de inducir la formación del producto.

Etapa IV: Fermentación de producción Dependiendo de la fermentació fermentación se utilizan biorreactores de distinto tamañ tamaño y no puede darse un esquema general para la inoculació inoculación de un fermentador de producció producción.

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II. RECUPERACION DE PRODUCTOS • • •

• • •

En una etapa de recuperación se optimiza la pureza y/o la concentración de un metabolito. En un proceso ideal de recuperación se optimizan ambos parámetros. Las técnicas utilizadas en la recuperación de productos químicos industriales (extracción, destilación, diálisis, cristalización, precipitación, desecación) fueron perfeccionadas para adaptarlas a materiales biológicos. No existe una operación única, ideal o universal, ni siquiera una secuencia de operaciones que puedan ser recomendadas. las operaciones individuales unitarias deben ser combinadas de la forma más adecuada para cada problema particular. En muchos casos la primera etapa de recuperación, al final de una fermentación, es la separación de los sólidos del líquido que casi siempre es acuoso.

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• • •

El producto final deseado puede ser el propio microorganismo o un metabolito que está presente intra o extracelularmente. Los metabolitos intracelulares se liberan de las células Las últimas etapas en la recuperación implican precipitación, cristalización y/o desecación

Ejemplos de metabolitos intracelulares: 1- los ácidos nucleicos 2- las vitaminas 3- las enzimas 4- ciertos antibióticos como la griseofulvina. Ejemplos de metabolitos extracelulares: 1-los aminoácidos 2- el ácido cítrico 3- el alcohol 4- algunos enzimas (amilasas y proteasas) 5- la mayor parte de los antibióticos (penicilina, estreptomicina).

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Principios del crecimiento bacteriano Los microorganismos pueden crecer en cultivos en lote (batch), lote alimentado (fed-batch) o cultivo continuo. 1-En la fermentación en lote, el medio de crecimiento estéril es inoculado con el microorganismo apropiado y la fermentación procede sin la adición de medio de crecimiento fresco. 2- En la fermentación en lote alimentado, los nutrientes son añadidos en forma incremental a varios tiempos durante el proceso de fermentación; no se remueve el medio de crecimiento hasta que termine el proceso. 3- En el proceso de fermentación continua, el medio fresco es añadido en forma continua durante la fermentación, pero al mismo tiempo un volumen igual de medio utilizado con el microorganismo suspendido es removido. Para cada tipo de fermentación se añade dentro del reactor, cuando es necesario, el oxigeno (el cual es usualmente provisto en forma de aire estéril), un agente antiespumante, y, si es requerido, ácido o base.

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Fermentación en lote

Durante la fermentación en lote, la composición del medio de cultivo, la concentración de microorganismos (concentración de la biomasa), la composición química interna de los microorganismos, y la cantidad de la proteína “target” o del metabolito, todas cambian como una consecuencia del estado de crecimiento celular, el metabolismo celular, y la disponibilidad de nutrientes. Bajo estas condiciones, se observan usualmente seis fases de crecimiento: fase lag, fase de aceleración, fase logarítmica o exponencial, fase de desaceleración, fase estacionaria y fase de muerte.

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Durante la fase logarítmica de crecimiento, la masa celular sufre varias duplicaciones y la velocidad de crecimiento específica del cultivo (μ) permanece constante. Cuando hay exceso de sustrato (suplemento de nutrientes) y no hay inhibición del crecimiento por un compuesto que está presente en el medio de crecimiento, la velocidad de crecimiento específica es independiente de la concentración de sustrato. En este caso, la velocidad de incremento de la biomasa celular con el tiempo, dX/dt, es el producto de la velocidad de crecimiento específico, μ, y de la concentración de la biomasa, X:

dX/dt = μ X

La velocidad de crecimiento específico, μ, es una función de la concentración del substrato limitante (por ej., la fuente de carbono o de nitrógeno) S, de la velocidad de crecimiento específica máxima, μmax, y de una constante específica de substrato Ks. Ambas S y Ks son expresadas en términos de concentración, por ej. en gramos o moles por litro. μ = μmax S / (Ks + S) Algunas veces los científicos se refieren al tiempo de duplicación o tiempo de generación (t) de un cultivo más bien que a una velocidad de crecimiento específica μ, donde t = ln2/μ. El tiempo de generación de un cultivo, es el tiempo que éste toma, bajo condiciones definidas, para que el número de células de la biomasa celular se duplique. Cuando hay un exceso de substrato (por ej., cuando S>> Ks), luego μ = μmax y se obtiene la velocidad máxima de crecimiento en fase logarítmica del cultivo.

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Fermentación en lote alimentado (Fed-Batch) En las fermentaciones en lote alimentado, el substrato es añadido en incrementos a varios tiempos a través del curso de la reacción. Estas adiciones prolongan tanto la fase log como la fase estacionaria, de esta forma se incrementa la biomasa y la cantidad de síntesis de metabolitos de fase estacionaria, tales como los antibióticos. Sin embargo, los microorganismos en fase estacionaria a menudo producen enzimas proteolíticas o proteasas, y estas enzimas pueden atacar algún producto sintetizado por un microorganismo modificado genéticamente. Luego, para las proteínas producidas por microorganismos recombinantes, es importante prevenir que la reacción de fermentación alcance esta parte del ciclo de crecimiento. Generalmente, las fermentaciones en lote con alimentación requiere más monitoreo y mayor control que las fermentaciones en lote y son luego utilizadas en menor medida. La adición periódica de substrato al cultivo microbiano en crecimiento prolonga la fase log de crecimiento y demora el “onset” de la fase estacionaria, la cual inicia las respuestas de stress celular, la producción de proteasas y otros cambios metabólicos que afectan el rendimiento de la proteína recombinante. Una estrategia de fermentación en fed-batch puede incrementar el rendimiento de 25% a mas de 1.000%, comparado con la fermentación en batch, dependiendo del microorganismo en particular, su background genético y la naturaleza de la proteína recombinante. Los procesos de fed-batch no se limitan solamente a células microbianas sino que pueden ser utilizados con cultivos de células de mamíferos y de insectos.

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Fermentación continua. En una fermentación continua, una condición de estado de equilibrio o “steady-state”, donde la variación de la concentración de la biomasa en función del tiempo es igual a cero (dX/dt = 0) se alcanza cuando el número total de células y el volumen total en el biorector permanecen constantes. En otras palabras, bajo esas condiciones, la pérdida de células debido al “outflow” o remoción del producto está balanceado exactamente por la ganancia de nuevas células por el crecimiento (división celular). Para obtener un cultivo estable termodinámicamente, la velocidad de crecimiento específica, μ, del cultivo debe ser menor que la velocidad de crecimiento máxima alcanzable, μmax. En la práctica, esta condición se alcanza ajustando la bomba que controla la velocidad de flujo volumétrico, mientras se mantiene el volumen del cultivo en el birreactor constante. El objetivo fundamental de la fermentación industrial es minimizar los costos y maximizar los rendimientos. Este logro se puede lograr a través de desarrollos tecnológicos que permitan una fermentación más eficiente para cada proceso en particular.

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Si bien los procesos de fermentación continua no son usados frecuentemente en procesos industriales, principalmente debido a la mayor experiencia que los científicos tienen con células creciendo en el modelo de lote o batch, el costo de producción de una biomasa celular por cultivo continuo es potencialmente mucho menor que el de producir la misma biomasa por fermentación en batch. Los factores que se indican a continuación dan cuenta para el ahorro de costos. 1- Fermentaciones continuas utilizan birreactores menores que los fermentadores en batch para producir la misma cantidad de producto. 2- Luego que una fermentación en batch en gran escala es completada, se necesita un equipo en gran escala para cosechar, romper las células, y el subsiguiente proceso de purificación de la proteína o del metabolito. En los procesos continuos a medida que se va produciendo el producto, éste se va procesando y de esta manera se requieren equipos más pequeños. 3- En las fermentaciones continuas se elimina el tiempo muerto entre corrida y corrida que hay en los cultivos en batch, durante el cual el birreactor es preparado para ser usado nuevamente (reparación, lavado, esterilización, etc). Fermentaciones continuas tienen menores tiempos perdidos porque una reacción simple puede ser mantenida por tiempos mas prolongados. 4- El estado fisiológico de las células durante la fermentación continua es más uniforme, debido a ello los rendimientos del producto tienden a ser más consistentes. En fermentaciones en batch, pequeñas diferencias en el tiempo de la cosecha de células (timing), la cual coincide con el crecimiento en fase media o logarítmica de crecimiento, pueden llevar a diferencias fisiológicas significativas. Las fermentaciones continuas pueden ser usadas para la producción comercial de proteína celular simple, antibióticos, y solventes orgánicos.

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FIN

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a) Batería de pequeños fermentadores de investigación. b) fermentadores industriales

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Producción de vinagre El vinagre es el producto resultante de la conversión del alcohol etílico en ácido acético por la acción de las bacterias del ácido acético que son de los géneros Acetobacter y Gluconobacter. El vinagre puede producirse a partir de cualquier sustancia que contenga etanol. La materia prima habitual es el vino, la cerveza o el zumo alcohólico de manzana. Las bacterias del ácido acético son aeróbicas pero no oxidan completamente sus dadores de electrones orgánicos hasta CO2 y agua, sino que lo hacen hasta ácido acético, son muy tolerantes a los ácidos. El problema principal en la producción del vinagre consiste en garantizar una aireación suficiente del medio. Existen tres métodos diferentes para la producción del vinagre: método de Orleans o de tinaja abierta, método de goteo (vinagre rápido) y método del burbujeo. La tinaja se denomina generador de vinagre Diagrama de un generador de vinagre. El líquido alcohólico se hace goteas a través de virutas de madera y se deja que el aire pase desde el fondo hacia arriba y a través de las virutas. Las bacterias del ácido acético se desarrollan sobre las virutas de madera y convierten el alcohol en ácido acético. La solución de ácido acético se acumula en una cámara colectora y se recicla a través del generador hasta que se alcanza un contenido en ácido acético de al menos 4%, cantidad mínima para ser considerado “vinagre”.

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Fermentación del ácido cítrico Se produce microbiológicamente por fermentación utilizando el hongo Aspergillus niger. Este hongo excreta grandes cantidades de ácido cítrico cuando el medio en el fermentador es deficiente en hierro, ya que el hongo superproduce el ácido cítrico como agente quelante para apoderarse del hierro. El medio de partida para la obtención del ácido cítrico puede ser muy variado (almidón de papa, hidrolizados de almidón, jarabe de glucosa procedente de almidón sacarizado, sacarosa, jarabe de caña de azúcar, melazas de caña de azúcar y melazas de remolacha azucarera). Si se utiliza almidón, las amilasas formadas por el hongo la hidrolizan a azúcares. Los azúcares se catabolizan a través de la vía glicolítica y entran en el ciclo del ácido cítrico, en el que tiene lugar la producción de citrato.

El proceso es aeróbico y se realiza en grandes fermentadores bien aireados. El ácido cítrico se produce de esta forma como un metabolito típico secundario. Durante la fase de crecimiento, la sacarosa se descompone en glucosa mas fructosa y, en el momento que se alcanza la fase estacionaria, quedan grandes cantidades de estas hexosas, que se convierten en ácido cítrico para contrarrestar la falta del hierro. El desarrollo de este tipo de fermentación aeróbica industrial tubo una gran importancia histórica y esta tecnología se aplicó luego a otras fermentaciones de antibióticos importantes como la penicilina.

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Usos industriales de las levaduras Las levaduras son los microorganismos más importantes y más ampliamente utilizados en la industria. Se cultivan por sus propias células, por sus componentes celulares y por los productos finales que producen durante la fermentación alcohólica. La producción de células de levadura y la producción de alcohol mediante levadura son dos procesos diferentes desde el punto de vista industrial en el hecho en que el primero requiere la presencia de oxígeno para la máxima producción de material celular, mientras que la fermentación alcohólica es anaerobia. Sin embargo en casi todos los procesos industriales se utiliza una misma especie de levadura, o especies similares de la misma, a saber , Saccharomyces cerevisiae.

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Producción industrial de células de levadura. Se utilizan como agente estimulante del leudado de la masa antes de la cocción. La levadura que se utiliza en panadería o para fines alimentarios se cultiva en grandes fermentadores aireados, en un medio que contiene melazas como agente principal. La melazas contienen grandes cantidades de azúcar que sirve como fuente de carbono y de energía y, además contienen minerales, vitaminas y aminoácidos que son utilizados por la levadura, se añade además fosfatos y sulfato de amonio como fuentes de fósforo, azufre y nitrógeno. No es conveniente añadir todas las melazas al mismo tiempo, ya que se producirá un exceso de azúcar y la levadura fermentará parte de éste azúcar en alcohol y CO2, en lugar de convertirlo en células de levadura. Las melazas se añaden a medida que el cultivo de levadura crece y consume este azúcar. Finalizado el período de crecimiento, las células de levadura se recuperan del caldo por centrifugación y se lavan mediante suspensión en agua y nueva centrifugación. La levadura de panadería se comercializa en forma de pastillas como levadura prensada (mezclada con otros aditivos como agentes emulsionantes, almidón, etc) o como polvo seco (levadura seca activa) luego de mezclarla con aditivos y secarla al vacío.

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Alcohol y bebidas alcohólicas El uso de levadura seca en la producción de bebidas alcohólicas es un proceso ancestral. La mayor parte de los zumos de fruta sufren una fermentación natural ocasionada por las levaduras “silvestres” que están presentes en la fruta. A partir de estas fermentaciones naturales se han seleccionado algunas levaduras para conseguir una producción más controlada. Las bebidas alcohólicas más importantes son el vino, producido por la fermentación del zumo de fruta, la cerveza, producido por la fermentación de cereales malteados, y las bebidas destiladas, producidas por concentración, mediante destilación, del alcohol procedente de una fermentación. Vinos: en general proceden de la uva. En los vinos secos se ha fermentado casi todos los azúcares del zumo o mosto; en los vinos dulces, se deja parte del azúcar, o bien se añade azúcar después de la fermentación. En un vino fortificado se le agrega algún licor después de la fermentación. En un vino espumoso se encuentra presente el CO2 que surge de una fermentación final que realiza la levadura directamente dentro de la botella. Bebidas alcohólicas destiladas Whisky, destilado de bebidas con malta; brandy es el destilado del vino; ron, destilado de melazas fermentadas; vodka destilado de cereales de papa fermentados.

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Fabricación comercial de vino a) Equipo para transportar las uvas hasta la bodega. b) Tanques grandes donde tiene lugar la fermentación principal del vino. c) Barricas en las que tiene lugar el proceso de envejecimiento.

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Fabricación de cerveza en una planta industrial. a, b)

Calderas de cobre donde el mosto se mezcla con el lúpulo y luego se lo lleva a ebullición. Desde la caldera, el líquido se pasa a grandes tanques de fermentación, en los que la levadura fermenta la glucosa y da lugar a etanol más CO2.

c) En cervezas tipo lager, la

cerveza se almacena barias semanas a baja temperatura en tanques, donde se produce la sedimentación de partículas, incluidas las células de levadura. d) La cerveza se filtra y se deposita en tanques de almacenamiento a partir de los que se envasa en barriles pequeños, en botellas o en latas.

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Bibliografía: Brock Biología de los Microorganismos (10ª Edición) Molecular Biotechnology Principles and Applications of Recombinant DNA (Second Edition). Bernard R. Glick and Jack J. Pasternak. http://nostoc.usal.es/sefin/MI/ TEMA 12: TIPOS DE FERMENTADORES Dr. Pedro F. Mateos González

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Streptomyces • • • • •

Streptomyces es el género más extenso de Actinobacteria, un grupo de bacterias Gram-positivas de contenido GC generalmente alto. Las especies del género Streptomyces se caracterizan por poseer un metabolismo secundario complejo (rutas metabólicas no requeridas para la supervivencia). Producen numerosos antibióticos de uso clínico como estreptomicina, ácido clavulánico, neomicina, cloranfenicol, etc El genoma completo de S. coelicolor A3(2), fue publicado en 2002. La secuencia genómica de S. avermitilis fue completada en 2003. Streptomyces spp. es objeto de investigaciones en biotecnología para la producción de proteínas recombinantes humanas porque tiene la habilidad de secretar proteínas recombinantes correctamente plegadas en el medio de producción, lo que simplifica los pasos subsecuentes de purificación. Esta característica, entre otras, hacen Streptomyces spp. una alternativa atractiva a otras bacterias tales como E. coli y Bacillus subtilis

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Streptomyces en Medicina Streptomyces es el género que produce el mayor número de antibióticos, tanto bactericidas como fungicidas, y también un amplio rango de compuestos bioactivos tales inmunosupresores. •

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Antibióticos antifúngicos – Nistatina (S. noursei) – Anfotericina B (S. nodosus) – Pimaricina (S. natalensis) Antibióticos antibacterianos – Eritromicina (S. erythreus) – Neomicina (S. fradiae) – Estreptomicina (S. griseus) – Tetraciclina (S. rimosus) – Vancomicina (S. orientalis) – Rifamicina (S. mediterranei) – Cloranfenicol (S. venezuelae) – Daptomicina (S. roseosporus) Inmunosupresores – Tacrolimus

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Desarrollo de agentes quimioterapéuticos •

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1900 Paul Ehrlich (concepto de toxicidad selectiva). Estudió sustancias químicas que teñian los microorganismos y no los tejidos. Descubrió el Salvarsán (compuesto que contiene arsénico) que se usaba para el tratamiento de la sífilis. 1930 Gerard Domang estudió en animales de experimentación numerosos productos químicos sintéticos, principalmente colorantes, que fuesen activos frente a enfermedades infecciosas. Descubrió las sulfamidas. El Pronotosil de la Compañía Química Bayer fue el primer compuesto activo con capacidad de curar infecciones estreptocócicas en ratones. El Pronotosil se degradaba a sulfanilamida en el cuerpo del animal y éste era el verdadero compuesto activo.

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Posteriormente D.D.Woods demostró que el ácido p-aminobenzoico contrarrestaba específicamente la acción inhibitoria de la sulfanilamida y que los estreptococos requerían el ácido p- aminobenzoico para su crecimiento. Esto condujo al concepto de análogo de factor de crecimiento, que permitió a los químicos proseguir con la síntesis de una gran variedad de agentes quimioterapéuticos. 1929 Alexander Fleming. Trabajaba con variantes de estafilococos. Descubrió una sustancia producida por un hongo del género Penicillum a la que llamó penicilina. 1939 Howard Florey y colaboradores produjeron penicilina a gran escala y demostraron que la misma era efectiva en el tratamiento de enfermedades infecciosas.

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Descubrimiento de la penicilina La penicilina G o bencilpenicilina fue el primer antibiótico empleado ampliamente en medicina; su descubrimiento ha sido atribuido a Alexander Fleming en 1928, quien junto con los científicos Ernst Boris Chain y Haward Walter Florey - quienes crearon un método para producir en masa el fármaco y probaron su eficacia para el control de enfermedades infecciosas- recibieron el Premio Nobel de Medicina o Fisiolofía en 1945 por sus descubrimientos. El premio en partes iguales, lo obtuvieron “for the discovery of penicillum and its effect in various infectious diseases”.

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Descubrimiento de la PENICILINA

Penicilina

Penicillum notatum Definida inicialmente como “antiséptico natural de efectos lentos”

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Historia de la penicilina •

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El descubrimiento de la penicilina según Alexander Fleming ocurrió el 28 de septiembre de 1928, cuando estaba estudiando cultivos bacterianos de Staphylococcus aureus en el sótano del laboratorio del Hospital St. Mary en Londres. La identificación del espécimen como Penicillium notatum la realizó Charles Tom. Desde 1929 y hasta 1940 sólo se utilizó el caldo del cultivo del Penicillum notatum como antiséptico local. La primera demostración de que la penicilina era útil para la medicina la llevó a cabo en 1930 el patólogo inglés Cecil George Paine discípulo de Fleming. En 1939 en la Sir Willam Dunn School of Pathology de Oxford los trabajos sobre la penicilina son retomados por E. B. Chain, H. W. Florey y N. G. Heatley. Chain se ocupó de las propiedades químicas y bioquímicas, Heatley de su producción (como obtener el principio activo y purificarlo de los caldos de cultivo) y Florey se encargó de los aspectos biológicos y farmacológicos y de la obtención de fondos.

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La purificación de la penicilina se produjo en 1939, a cargo del bioquímico Norman George Heatley. A Heatley no le alcanzó la fama ni la publicidad ni la fortuna. Los honores llegaron más tarde cuando se retiró, en 1978 recibió la Orden del Imperio Británico (OIB) y en 1990, la Universidad de Oxford le confirió el grado honorario de Doctor en Medicina, el primero conferido en 800 años de historia de la Universidad. La interpretación mas breve y acertada de esta historia es la de Henry Harris, sucesor de Florey en la Sir William Dunn School of Pathology: To sum it all up: without Fleming, no Chain or Florey; without Chain, no Florey; whithout Florey, no Heatley; without Heatley, no penicillin. (Harris H. Howard Florey and the development of penicillum. Notes Rec R Soc Lond. 1999; 53:243-52) Sacado del editorial sobre la historia de la penicilina. La segunda línea de Juan Antonio Barcat. http://www.medicinabuenosaires.com/revistas/vol66-06/4/EditorialSobre%20la%20historia%20de%20la%20penicilina.pdf

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EL PREMIO NOBEL

FLEMING

FLOREY

CHAIN

PREMIO NOBEL DE MEDICINA Y FISIOLOGÍA EN 1945

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“Todos sabemos que la casualidad, la fortuna o el destino, como cada cual desee llamarlo, ha jugado un papel destacado en muchos de los grandes descubrimientos científicos. Esto es especialmente acertado en el caso de la Biología, puesto que trata de los mecanismos de la vida, sobre la que existen multitud de lagunas en nuestro conocimiento.” A. Fleming

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Evaluación de antimicrobianos

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Cultivos biotecnológicos en la Argentina Reporte Anual 2008 - Argentina es el segundo productor mas grande de cultivos biotecnológicos (después de Estados Unidos), con un área estimada de 19,8 millones de hectáreas para la cosecha 2007/08 (soja, algodón, maíz). Soja: 100%, variedad obtenida por biotecnología (17millones de hect.) Maíz: 74%, variedad obtenida por biotecnología Algodón: 90%, variedad obtenida por biotecnología - Introducción de la soja biotecnológica en la Argentina en 1990. - En Mayo del 2008 la Secretaría Argentina de Agricultura , Ganadería, Pesca y Alimentos (SAGPyA) aprobó la utilización de una variedad de maíz con la suma de tres desarrollos biotecnológicos en un mismo producto, variedad HX+LL+RR (tolerancia a los herbicidas Glyphosate y Glufosinate y resitencia a Lepidoptera). HX (Herculex I technology) protección contra insectos LL (Liberty Link technology) resistencia al glufosinato de amonio y RR (Rounup Ready technology) resistencia al glifosato; ambos herbicidas.

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En la Argentina hay doce variedades biotecnológicas aprobadas para su producción y comercialización: - 1 para soja (empresa Monsanto) - 2 para algodón (Monsanto) - 9 para maíz ( Ciba-Geigi. AgrEvo, Monsanto, Novartis, Syngenta, Dow/Pioneer y Pioneer. Soja -En 1996 fue liberado el cultivo de soja tolerante a glifosato (Roundup Ready soybean). Este cultivo fue el primero introducido en la agricultura Argentina y permitió la incorporación del cultivo doble de soja (siguiendo al de trigo) en muchas áreas donde solo se plantaba un cultivar. - En Argentina la economía de la soja esta orientada casi totalmente a la exportación: 2%, uso domestico, 30% exportado como grano y el 68% es procesado por la industria de los aceites de semilla. -93% del aceite de semilla y 99% de los productos laterales (alimentos) son exportados.

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En 2007 el gobierno simplificó el proceso de aprobación para eventos apilados, permitiendo aplicaciones para un cultivo transgénico combinando dos eventos ya aprobados sin un análisis total del nuevo cultivo.

Maíz -En Agosto de 2007 se aprobó en la Argentina el primer producto en el cual se había apilado la suma de dos desarrollos biotecnológicos permitiendo a la empresa Monsanto la introducción de un maíz de una variedad modificada para producir una sustancia tóxica para los parásitos taladradores de maíz y para la resistencia a glifosato, un herbicida para el control de malezas (variedad NK603x810). - En Mayo de 2008 Pioneer recibió aprobación para una variedad de maíz conteniendo un desarrollo para la protección contra insecto y resistencia a los herbicidas glufosinato y glifosato. 74% del área plantada representa variedades biotecnológicas. 63% variedad de maíz Bt 9% tolerante a glifosato 2% variedades con eventos apilados (aproximadamente 82.000 hectáreas).

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Algodón 90% del área plantada corresponde a algodón modificado por biotecnología. 44% resistente a glifosato y 57% resistente a lepidóptero (variedad Bt). Debido al menor uso de insecticidas se mostró una ventaja económica al usar las variedades modificadas. Se están llevan a cabo en el INTA investigaciones para obtener variedades de algodón coloreadas. Aceite de semillas de colza El Instituto Nacional de Semillas (INASE) tiene prohibido la importación de semillas de colza biotecnológica y estableció el requerimiento de un certificado de ausencia de semillas de colza biotecnológica en los embarques de semillas. Vacas clonadas: tecnología de vanguardia Argentina fue el primer país de América latina en desarrollar dos generaciones de vacas clonadas capaces de producir la hormona de crecimiento humana.

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En Marzo de 2006, CONABIA (Comité Asesor Nacional de Biotecnología en Agricultura) y SENASA (Servicio Nacional de Agricultura y Calidad y Sanidad Animal) aprobó el primer paso para autorizar la producción de hormona de crecimiento humana en leche. El próximo paso que necesita para ser completada es la aprobación por la Secretaría de Salud Pública. Los terneros clonados, Pampa Mansa II, Pampa Mansa III y Pampero, desarrollados por la compañía Biosidus, llevan un gen que produce la hormona de crecimiento humana en la leche. La leche producida por una sola vaca puede alcanzar para la demanda entera de nuestro país. En el 2007, la compañía Biosidus desarrolló otra línea de vacas clonadas, esta vez para producir insulina. Después de 4 años de investigación y mas de 4 millones de dólares invertidos, “Patagonia” fue la primera vaca clonada. En este caso, la insulina producida por 25 vacas como Patagonia podrían satisfacer la demanda anual de nuestro país a un costo bajo (30% menos que el costo actual de la insulina). La intención es producir suficiente insulina como para ser capaces de exportar en un futura cercano.

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Política Biotecnológica Sistema regulatorio de Bioseguridad El sistema regulatorio de bioseguridad en la Argentina esta basado sobre la evaluación del producto y no del proceso a través del cual este es obtenido. La evaluación tiene lugar sobre la base de caso por caso, tomando en consideración el proceso solo en el caso donde el medio ambiente, la producción de la agricultura o la salud de animales o humanos puedan estar en riesgo. La oficina clave dentro de la SAGPyA que centraliza todas las actividades biotecnológicas y la información es la Oficina de Biotecnología creada en 2004. Esta oficina coordina tres áreas técnicas: - Asuntos de bioseguridad (la autoridad es un miembro de la CONABIA) - Policía de análisis y formulación - Diseño Regulatorio

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PROCESO DE BIOSEGURIDAD NACIONAL

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Los cultivos mejorados por la biotecnología moderna son autorizados en la Argentina por la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentación (SAGPyA), a partir de los informes de sus comisiones asesoras: La Comisión Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria (CONABIA). El Comité de Evaluación de Organismos Genéticamente modificados (OMG) del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA). La Dirección Nacional de Mercados Agroalimentarios (DNMA).

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PROCESO DE BIOSEGURIDAD NACIONAL CONABIA Evalúa el posible impacto ambiental y autoriza la liberación del cultivo transgénico al agroecosistema. El Comité de evaluación de OGM del SENASA estudia la seguridad alimentaria del cultivo transgénico (o de sus subproductos) y lo autoriza para el consumo humano y animal.

DNMA Estudia el impacto del cultivo transgénico en el mercado nacional e internacional.

Secretario de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentación

APROBACIÓN Hoy en la Argentina hay tres cultivos transgénicos: el maíz, el algodón y la soja.

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Bibliografìa: USDA Foreing Agricultural Service Gain Report Date: 7/14/2008 Gain Report Number:AR8028 Argentina Biotechnology Annual Report 2008

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Integran en Estados Unidos la producció producción de carne y etanol En USA se puso en marcha la primera planta de etanol a partir de maí maíz que opera en “circuito cerrado” cerrado”, con un sistema de engorde de ganado vacuno con una capacidad de de 28.000 cabezas de ganado. Del maí maíz se obtiene un biocombustible, biocombustible, el etanol, y con el residuo se engordan novillos. La empresa es E3 BioFuels Genesis y producirá producirá 100.000 metros cú cúbicos de etanol por añ año, para lo cual requerirá requerirá unas 50.000 toneladas de maí maíz. La tecnologí tecnología implementada ofrece grandes beneficios econó económicos y ambientales. La materia prima que utiliza el sistema integrado es el maí maíz, que ingresa en la planta de etanol. Allí Allí se muele y se pone a fermentar en agua para obtener el etanol, que luego se separa por un proceso de destilació destilación. El residuo de la fermentació grains” es un excelente alimento para fermentación llamado “wet distillers grains” el ganado vacuno. Por eso se construyó construyó, al lado de la planta, un corral de engorde de novillos con piso ranurado. ranurado. Por las ranuras caen los excrementos de la hacienda, que alcanzan a las 300.000 toneladas anuales. Un sistema automá automático traslada la bosta a un par de tanques anaeró anaeróbicos en los que se convierte en biogá á s, por medio de la fermentació ó n bacteriana. Esto evita el principal biog fermentaci problema de los sistemas de engorde intensivo de ganado, que es la polució polución del medio ambiente. Se reducen drá drásticamente los olores y la contaminació contaminación de las aguas. Las heces del ganado quedan siempre atrapadas en el fermentador. El agua luego luego es tratada como en una fá fábrica y los residuos só sólidos vuelven al campo como fertilizantes. El mayor beneficio es el ahorro de energí energía ya que el biogas se utiliza en la caldera que produce el vapor necesario para el proceso de destilació destilación. La planta de etanol, de esta manera, no requiere aporte externo de energí energía.

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UN PROCESO REVOLUCIONARIO Biodigestor

(Produce Biogas metano) El biogas provee el 100 % de la energía que requiere la planta de etanol

El ganado produce bosta que luego se convierte en metano

Integración en circuito cerrado Ganado en engorde

Maíz

Planta de Etanol

Carne

Etanol De la planta de etanol sale la comida que necesita el ganado

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Este tema reviste interés para la Argentina por que: Consolida la demanda de maíz, el segundo rubro exportable del país atrás de la soja. 2) Da por tierra con la idea de que destinar granos- como el maíz- a la producción de energía implica restarlos del circuito alimentario. De esta forma se integra todo en un alto nivel de eficiencia. Sacado de artículo del Diario Clarín (1º de Marzo de 2007, sección Agronegocios, H. A. Huergo) .

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FIN

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