Artigo Sobre Cromatografia Gasosa - Final 3530r
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Cromatografia e suas aplicações
RESUMO
Atualmente muitas são as técnicas analíticas que podem ser efetuadas em laboratórios com maior praticidade e eficiência com o intuito de obter resultados qualitativos e quantitativos com maior segurança. Uma técnica muito utilizada para separar substâncias é a cromatografia. Esse artigo objetiva mostrar a eficiência, vantagens e desvantagens desse método de separação e quais aspectos positivos fazem com que esse método analítico seja um dos mais utilizados sendo também muito eficiente, considerando que para análise quantitativa de dados dos trabalhos analisados será dada ênfase na cromatografia gasosa.
Palavras-chave: Cromatografia, fase, quantitativa.
ABSTRACT
Currently there are many analytical techniques that can be performed in laboratories with greater convenience and efficiency in order to obtain qualitative and quantitative results with greater security. A widely used technique for separating substances is chromatography. This article aims to show the efficacy, advantages and disadvantages of this method of isolation and positive aspects which make this analytical method is one of the most used is also very efficient, whereas data for quantitative analysis of the studies analyzed emphasis will be placed in gas chromatography .
Keywords: Chromatography, phase, quantitative.
1.0 - Introdução
a técnica para a separação de pigmentos
O termo cromatografia é atribuído
presentes em folhas de plantas, através da
ao botânico russo Mikhael Semenovich
agem de extratos de folhas, arrastados
Tswett que, no início do século empregou
por éter de petróleo, através de leitos de
carbonato de cálcio finamente dividido. As
quantitativa,
espécies separadas (clorofilas e xantofilas)
cromatografia ou em conjunto com outras
apareciam
técnicas
nos
leitos
como
bandas
pela
própria
experimentais,
técnica
tais
de
como
a
coloridas, e por isso Tswett chamou o
espectrofotometria ou a espectrometria de
método de cromatografia, do grego chroma
massas. [1]
(cor) e graphein (escrever).[1]
No que diz respeito à classificação,
A definição de cromatografia dada
os métodos cromatográficos podem ser
pela IUPAC em 1993 é a seguinte:
classificados de duas formas. A primeira,
“cromatografia é o método físico de
mais simples, é baseada na forma pela qual
separação no qual os componentes a serem
as duas fases são colocadas em contato.
separados se distribuem entre duas fases,
Segundo
esse
uma das quais estacionária, enquanto a
poderiam
ser
outra
categorias: [1]
se
movimenta
numa
direção
critério,
os
classificados
métodos em
duas
definida”. A mistura que contém os
cromatografia em coluna, na qual a fase
componentes
é
estacionária é mantida dentro de um tubo,
dissolvida na fase móvel. Durante a
em geral bastante estreito, dentro do qual a
agem da fase móvel através da fase
fase móvel é forçada por efeito de pressão
estacionária,
ou pela efeito da gravidade;
a
serem
alguns
separados
componentes
são
fortemente retidos pela fase estacionária e
cromatografia planar, na qual a fase
por isso se movem lentamente com o fluxo
estacionária é ada numa superfície
da fase móvel; enquanto isso, outros
plana ou nos interstícios de um papel. A
componentes interagem fracamente com a
fase móvel se move através da fase
fase estacionária, sendo transportados mais
estacionária por efeito da capilaridade ou
facilmente pela fase móvel. Devido a essas
da gravidade. Outro critério de classificação, mais fundamental, é baseado nos tipos de fases
diferenças em mobilidade, os componentes
estacionárias e móveis, e nos mecanismos
da
envolvidos nas transferências de solutos
mistura
analisados
podem de forma
ser
separados
e
qualitativa e/ou
entre as fases. [1]
A fase estacionária pode ser sólida
último caso, a fase líquida pode ser
ou líquida. No caso de fase estacionária
chamada de “fase ligada”. A fase móvel
líquida, o líquido pode simplesmente estar
pode ser líquida, gasosa ou um fluído
espalhado sobre um e sólido ou
supercrítico. [1]
então estar imobilizado sobre este. Neste
Os mecanismos que podem estar
1.3 - Troca Iônica: A fase estacionária é
envolvidos em processos cromatográficos
constituída de uma matriz onde são
são mencionados nas Figuras 1.1 a 1.5, a
adicionados grupos funcionais ionizáveis
seguir.
(catiônicos ou aniônicos). A fase móvel é, geralmente, uma solução iônica com 1.1
Waals,
-
Adsorção:
propriedades tamponantes, escolhidas de
Processo baseado em
forma a ser compatível com o tipo de
interações eletrostáticas,
trocador
dipolares
grupos funcionais, ligados quimicamente à
(Van
de
por exemplo) ou pontes de
matriz
usado.
Bioafinidade:
estacionária,
que
utiliza
possuam
hidrogênio, que ocorrem entre grupos ativos presentes na superfície da fase estacionária sólida e a fase móvel. Em processos cromatográficos, a adsorção é sempre reversível (a dessorção do soluto
especificidade biológica. Esses grupos
implica na volta deste à fase móvel). [1]
retiram da fase móvel somente as suas espécies complementares, deixando ar
1.2
-
Quando estacionária
todas as outras espécies. [1]
Partição: a
fase é
um
líquido, espalhado na superfície de um e sólido e inerte ou nas paredes de um tubo, o processo é interfacial, ocorrendo por absorção, ou partição, que se baseia nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionária. [1]
1.4
-
Bioafinidade:
Utiliza
grupos
funcionais,
ligados
quimicamente à matriz estacionária, que possuam especificidade biológica. Esses grupos retiram da fase móvel somente as suas espécies complementares, deixando ar todas as outras espécies. [1]
1.5 - Exclusão: Baseia-se
poros)
em um processo puramente
presentes na fase móvel podem ser
mecânico. A fase estacionária é uma matriz
separados porque os menores são capazes
de
textura
de penetrar facilmente em todos os poros
(superfície e distribuição de tamanhos de
da fase estacionária, equilibrando-se com a
composição
inerte,
com
controlada.
Os
componentes
fase móvel que também entra nos poros,
quimicamente ligadas a um e sólido
enquanto
excluídas,
também podem apresentar um mecanismo
acompanhando a fase móvel que fica fora
de separação que é um compromisso entre
dos poros. As moléculas com tamanho
adsorção (sobre sítios ativos do e
intermediário entre esses dois extremos
sólido) e partição (que ocorre na fase
migram com velocidades variáveis, sendo
líquida
que possuem penetração seletiva nos
contribuição relativa de cada mecanismo
poros, entrando em alguns, mas não em
depende da quantidade relativa de cada
todos. [1]
tipo de grupo funcional existente.
as
maiores
são
A cromatografia vem apresentando crescente
utilização
ligada).
A
Uma
classificação dos métodos cromatográficos,
ferramenta
retirada de Collins et al. (1990), é
analítica devido à sua simplicidade, ao
apresentada na Tabela 1.[1] Tabela 1 -
custo relativamente baixo, à vasta gama de
Classificação
aplicações possíveis e à possibilidade de
cromatográficos, retirada de Collins et al.
fornecer dados quantitativos confiáveis. [1]
(1990)
Processos utilizam
fases
como
quimicamente
cromatográficos estacionárias
dos
métodos
que
líquidas
A análise quantitativa está baseada
aqueles obtidos a partir de um ou mais
na comparação das alturas ou das áreas dos
padrões. Se as condições operacionais
picos
forem bem controladas, esses parâmetros
correspondentes
aos
compostos
presentes nas misturas sob análise com Técnica
(altura
e
PLANAR
Fase Móvel
.
Líquida Sólido Ligada
Tipo de
CCD
dos
picos)
variam
EM COLUNA
Líquida
Fase Estacionária
área
CCD
Gasosa
Fluido Supercrítico
Líquida Sólido Ligada CGL
CGS
Sólido Ligada
CGFL
CSS
CSFL
Líquida Líquida Sólido CLL
Ligada
CLS CE CLFL CTI CB
Cromatografia
Sigla em
Nome da Técnica
Português
Sigla em
Nome da Técnica
Português
Cromatografia em papel
CSFL
Cromatografia supercrítica com fase ligada
CCD
Cromatografia em camada delgada
CLL
Cromatografia líquido-líquido
CCD
Cromatografia em camada delgada
CLS
Cromatografia líquido sólido
CGL
Cromatografia gás-líquido
CE
Cromatografia por exclusão
CGS
Cromatografia gás-sólido
CLFL
Cromatografia líquida com fase ligada
CGFL
Cromatografia gás fase ligada
CTI
Cromatografia por troca iônica
CSS
Cromatografia supercrítica com fase estacionária
CB
Cromatografia por bioafinidade
sólida
linearmente com a composição. [1] Numerosos descritos
para
métodos
detecção
evitar erros comuns experimental, e para
tem
dos
sido
encontrar as melhores maneiras de eliminar
vapores
sua interferência durante a fase de análise
orgânicos eluídos num cromatógrafo a gás.
quantitativa. [3]
Os principais métodos de detenção são classificados
de
acordo
com
Tappin et al., (2004), desenvolveu
as
um trabalho de análise quantitativa com
propriedades físicas que configuram o
Cromatografia Gasosa utilizando Detector
mecanismo de detecção. Os detectores são
por Ionização de Chama GC-FID utilizada
classificados como: universal, seletivo e
para análise de óleos de copaíba metilado,
específico. Os detectores de ionização de
utilizando trans-(-)-cariofileno, ou copalate
chama e condutividade térmica respondem
metilo como padrões externos. Curvas
na presença de todos os compostos
analíticas mostraram boa linearidade e
orgânicos e são portanto considerados
reprodutibilidade em termos de correlação
detectores universais. Outros detectores
de
respondem somente na presença de um
respectivamente) e desvio padrão relativo
heteroátomo em particular (por exemplo,
(<3%). Quantificação de sesquiterpenos e
fotométrico de chama e termoiônico são
ácidos diterpenic foram realizados com
considerados detectores específicos). O de
cada
captura de elétrons é considerado seletivo,
comparado
pois detecta qualquer substância que
resposta integrada, a padronização foi
apresente grupo atômico capaz de captar
estatisticamente semelhante para o caso de
elétrons. [2]
copalate de metila, mas a resposta de trans-
Ligiero et al., (2009), desenvolveu
coeficientes
padrão,
e
separadamente.
com
(-)-cariofileno
(0,9992
a
foi
0,996,
Quando
normalização
da
estatisticamente
um experimento que consistiu na extração
diferente (P <0,05). Este método mostrou-
e análise de eugenol a partir de sementes
se adequado para a classificação e controle
de cravo para realizar uma abordagem
de qualidade de amostras comerciais de
quantitativa, que teve como objetivo
óleos. [4]
comparar
os
por
Silva, Silva e Druzian (2010),
procedimentos de calibração interna e
desenvolveram uma pesquisa no intuito de
externa. Portanto, esta experiência mostrou
pesquisar a existência de um antibiótico
ser ferramenta muito eficaz para aumentar
em leite caprino que pode ser nocivo à
a
população.
consciência
resultados
dos
obtidos
alunos
sobre
a
Os
antibióticos
e
outros
necessidade de compreender os diferentes
medicamentos istrados em animais
tipos de calibração no GC e sobre como
podem caracterizar perigos relacionados ao
risco de intoxicações de origem alimentar
na população. O presente trabalho consiste
para os humanos. Devido a isto, o
na otimização e validação de metodologia
monitoramento
de
analítica para determinação de resíduos de
medicamentos veterinários em alimentos
cloranfenicol em leite de cabra por GC /
tornou-se
preocupação
ECD. A extração foi feita com acetato de
constante dos consumidores, órgãos regu-
etila e do clean-up com o SPE-C18. A
ladores e instituições de pesquisa. A
identificação foi feita por comparação do
presença de resíduos de cloranfenicol em
tempo
leite de cabra pode causar efeitos tóxicos
quantificação por padronização externa. [5]
uma
dos
área
resíduos
de
de
retenção
e
GC/MS,
2.0 – Esquema de Cromatógrafo
Figura 2 – Esquema de Cromatógrafo Gasoso. [6] 2.1 – Sistema de bombeamento e pressurização A tabela 2 apresenta características de sistemas de bombeamento e pressurização. [7]
Tabela 2. Características de três tipos de sistemas de pressurização
ea
Tipo
de
Funcionamento
Vantagens
Limitações
Uso
pressurização
um líquido em um
é a opção mais fácil e barata
este sistema é bastante
se o sistema
pneumática
recipiente metálico é
de se implementar em um
limitado, uma vez que
disp
pressurizado
laboratório, pois o vaso de
amaior pressão disponível
de uma boa válvula
diretamente com
pressurização pode ser
de se obter é igual à
de alta pressão, a
nitrogênio (ou outro
construído em uma oficina
do cilindro de nitrogênio
programação de
gás inerte)
mecânica simples
(aproximadamente 160
pressão é possível,
bar)
podendo ser
Bomba
efetuados incrementos contínuos pistão
é uma bomba típica de
sistema
amplamente
reciprocante
HPLC; funciona com
utilizado
um ou dois pistões de
possível
pequeno volume que
satisfatoriamente a pressão
eletrônico ou mecânico,
ambiente, nenhuma
alternadamente puxam
e operar facilmente com
para
um
modificação
o líquido do
programação
bombeamento
de
necessária,
reservatório e o
composição de fase móvel
comprimem em direção
e/ou
à coluna cromatográfica
modificadores
em
HPLC;
existe a necessidade de
é
instalação
controlar
supressor
de
adição
de de
se
se um
pulso,
obter livre
pulsação
o
fluido
for
líquido
à
temperatura
é porém
se o fluido for um
de
gás,
então
é
necessário refrigerar a bomba
seringa
funciona
funciona
como
um
é a mais indicada para o
sem dúvida, a bomba
a
pistão
uso em SFC pois apresenta
seringa é a opção de
preenchida com o
único, porém de grande
fluxo
rápida
melhor desempenho por
fluido
volume (~20 mL)
resposta à programação e
ser livre de pulsação e por
composição a ser
permite também a utilização
atingir
usado, podendo ser
de
fluido
porém também é a de
usado
que
maior custo e não permite
vazão ou pressão
estejam no estado líquido
mudança
constantes ou com
(para
composição de fase móvel
estável,
gases
como
supercrítico,
tal
desde
é
necessário
altas
pressões,
rápida
de
resfriar o sistema antes da
seringa
é
na
tanto
gradiente
com
de
densidade
pressurização)
2.2 Injetores Vários autores pioneiros chegaram
descreveram um sistema onde a amostra
a construir seus próprios injetores. Jentoft e
era injetada pneumaticamente para dentro
Gouw montaram um injetor de alta pressão
da
do tipo “stop flow”. Sie e Rijnders
desenvolvidos sistemas de injeção de
coluna.
Atualmente
estão
sendo
amostras para alta pressão baseados no
apresentadas algumas relações de volume
tempo, os quais possibilitam a injeção de
de injeção em função do diâmetro e
volumes bastante reduzidos com alta
comprimento da coluna. [7]
precisão e exatidão. Na Tabela 3 são
Tabela 3. Volumes típicos de injeção (Vinj) em função do diâmetro interno (d.i.) e comprimento (L) da coluna capilar. [7]
Diâmetro interno Volume do injetor Comprimento da coluna d.i. (μm)
Vinj (μL)
L (m)
200
1,50
4,8
100
0,27
3,4
50
0,05
2,4
Injetores: Seringas
Firgura 3 – Injeção com seringas. [8] 2.3 - Colunas Um
resumo
das
vantagens
e
desvantagens do uso das colunas capilares
e empacotadas é apresentado na Tabela 4.[7]
Tabela 4. Resumo das características do emprego das colunas capilares e empacotadas [7]
Coluna capilar Vantagens: • Baixa queda de pressão • Alta eficiência • Facilidade de interface com detectores FID e MS • Baixa vazão de fase móvel (bomba seringa) Desvantagens: • Baixa velocidade ótima • Difícil controle de vazão • Baixa sensibilidade com detectores UV e IR Coluna empacotada Vantagens: • Menor tempo de análise • Alta capacidade de amostra (sensibilidade) • Possibilidade de uso de detectores UV e IR Desvantagens: • Alta queda de pressão • Baixa eficiência • Grande área superficial (possível efeito de adsorção)
2.4 – res
Os res são usados para que se
tipos de res: r de sílica
mantenha a pressão homogênea dentro da
fundida, r de sílica fundida não
coluna cromatográfica. res mais
tratada, r de aço inox, r de
simples são constituídos de tubo de sílica
vidro Pyrex e r de filtro sinterizado
fundida de pequeno diâmetro interno (<10
microporoso, tendo obtido um melhor
μm) como o utilizado por McNair e
resultado com o primeiro. [7]
Hensley. Bertsch e Green compararam 5
Figura 4 - Diagrama de vários res que podem ser usados para SFC. A)de sílica fundida com redutor, B) de sílica fundida com extremidade cônica, C) e D) de sílica fundida com diferentes diâmetros de orifício, E) de sílica fundida com orifício interno formado a partir da compressão da coluna à temperatura elevada, F) formado pela deposição de material no final do capilar, G) de orifício tipo “pinhole”, muito usado para SFC-MS, H) de sílica fundida formada por filtro poroso (“frit”), I) r com a extremidade comprimida (“pinched”). 3.5 – Detectores
Destrutivos/não destrutivos; Os
Classificados quanto a seletividade: Universais, Seletivos ou Específicos. Características desejáveis:
detectores
utilizados
nas
pesquisas mostradas neste trabalho são os detectores por ionização de chama. Um detector de ionização de chama
Sensibilidade elevada;
(FID ou DIC) consiste em uma chama de
Baixo nível de ruído;
hidrogênio (H2)/ ar e um prato coletor. O
Resposta para os compostos de interesse
efluente a da coluna do CG através da
(universais, seletivos e específicos);
chama, a qual divide em moléculas
Ampla faixa de linearidade;
orgânicas e produz íons. Os íons são
Quantidade mínima detectada;
recolhidos em um eletrodo negativo e
Insensível a pequenas mudanças de
produzem um sinal elétrico. O FID é
fluxo e temperatura;
extremamente sensível com uma faixa
dinâmica grande. Sua única desvantagem é
(He2) ou hidrogênio mais nitrogênio (N2).
que
amostra.
Os íons e elétrons que se formaram na
Os detectores por ionização de chama são
chama ficam presos em um eletrodo
usados para detectar hidrocarbonetos (HC)
permitindo que uma corrente flua no
como o metano (CH4), etano (C2H6),
circuito externo. A corrente é proporcional
acetileno (C2H2), etc. [9]
aos íons formados, o que depende da
Alta sensibilidade: determinações até
concentração de hidrocarbonetos nos gases
-13
e é detectada por um eletrômetro e
10
destrói
a
g/mL.
mostrada na saída análoga. [9]
Simplicidade.
Gás de arraste: estabilidade térmica e
inércia química
Hidrogênio,
Helio e
Nitrogênio.
O FID oferece uma leitura rápida, precisa e contínua da concentração total de HC para níveis tão baixos como ppb.
[9]
A amostra a ser analisada mistura-se com hidrogênio (H2), hidrogênio mais hélio 3.0 – Áreas de aplicação
desenvolvimentos de processos para a indústria
farmacêutica,
de
alimentos,
cosmética, de engenharia de alimentos, de perfumaria
e
para
as
indústrias
de
processamento químico, com as seguintes finalidades: [11]
Preparação
representam componentes
de
mais
extratos
que
fielmente
os
das
matérias-primas
originais, tanto do aspecto químico quanto do ponto de vista sensorial;
Figura 5 – Detector por ionização de chama.
Isolamento,
remoção,
e/ou
concentração de princípios ativos naturais,
[10]
tais
como:
antioxidantes,
corantes,
constituintes organolepticamente idênticos, constituintes Pelo processo da extração por fluido supercrítico, podem ser feitos
fitoterápicos
e
produtos
indesejáveis, como a nicotina, a cafeína e certos componentes tóxicos;
Extração
de
matérias-primas
e
fármacos de fontes botânicas;
Processamento
de
produtos
Extração de derivados da lignite;
Extração
de
hidrocarbonetos
líquidos do carvão de pedra e da hulha;
sanitários e suplementos alimentícios;
plantas aromáticas, etc. [011]
Produção de uma variedade de
oleorresinas
de
condimentos
de
Extração de óleos essenciais de
alta
De forma geral CG e aplicável para
qualidade;
separação e análise de misturas cujos
Purificação de polímeros;
constituintes tenham pontos de ebulição de
Extração
e
refino
de
óleos
até 300oC e que são termicamente estáveis.
comestíveis;
[10]
Concentração de óleos cítricos;
Extração e fracionamento de óleos
•
Análise de ácidos graxos e triglicerídeos; Análise
de
compostos
voláteis
de sementes e ácidos graxos;
responsáveis pelo aroma característico de
alimentos;
Extração de aromas e constituintes
cosméticos;
• Análise de açucares;
• Análise de amino ácidos;
Extração de inseticidas naturais de
plantas;
• Análise de pesticidas;
• Separação de pesticidas de amostra de
Extração dos corantes da páprica,
cúrcuma, urucum, genipapo, tagetes e
vinho;
pimentas vermelhas;
• Análise de fármacos e etc. [10]
Extração da lecitina pura da lecitina 4.0 – Análise Quantitativa a partir da
bruta;
Separação do colesterol da gema de
Cromatografia Gasosa
ovo, de gorduras animais e de carnes;
Extração
rápida
de
produtos
Para quantificação de dados foi utilizada a
naturais, como café, lúpulo, cafeína,
cromatografia
lipídios;
trabalhos
Separação
de
aromáticos
de
produtos do petróleo;
Remoção de metais do resíduo do
petróleo;
4.1 - Obtenção do óleo de cravo-da-índia
gasosa,
foram
pois,
desenvolvidos
muitos dando
ênfase a esse tipo de cromatografia considerada muito eficiente.
1,8 mL min-1. O volume de injeção foi de 1 μL. Os tratamentos estatísticos e a
Condições cromatográficas
As análises cromatográficas foram
geração dos gráficos foram feitos no software Origin 7. [3]
Resultados e Discussão
realizadas em um cromatógrafo a gás acoplado a um detector de ionização em chama (CG-DIC) modelo Shimadzu 17A, utilizando uma coluna DB-1 J&W de 30 m, diâmetro interno 0,25 mm e espessura do filme de 0,25 μm. A temperatura do injetor e do detector foram mantidas em 200 e 230 oC, respectivamente, e a programação do forno foi de 50 até 230 oC com uma taxa de aquecimento de 15 oC min-1. O gás carregador utilizado foi o hidrogênio com uma vazão na coluna de
A Figura 6 mostra o cromatograma obtido a partir da injeção de um dos padrões. Os sinais com tempos de retenção de 5,32 e 6,29 min referem-se à carvona (padrão
interno)
e
ao
eugenol,
respectivamente. É possível observar na figura que a resolução obtida permitiu a separação completa dos dois componentes, não havendo sobreposição dos picos cromatográficos. Os valores obtidos para as áreas dos padrões e a razão entre as áreas são apresentados na Tabela 4. [3]
Figura 6 - Cromatograma do padrão contendo eugenol e carvona.
Tabela 4. Resultados das injeções dos padrões
A curva de calibração direta, Figura
significativa entre os dados. Já a curva para
7, foi obtida através de um gráfico da
calibração interna, Figura 8, foi construída
concentração de eugenol versus a área dos
usando a concentração de eugenol versus a
respectivos sinais. O valor do coeficiente
razão entre as áreas dos sinais de eugenol e
de correlação linear (R) de 0, 97007, maior
carvona de cada solução-padrão. O valor
que o valor crítico tabelado de Pearson
de R= 0, 99867 mostra que a correlação
para N= 5 (N é o número de pontos da
linear para este caso foi mais significativa
curva)
que para a curva anterior. [3]
indica
uma
correlação
linear
Figura 7 – Curva de calibração externa do
Figura 8 – Curva de calibração utilizando
Eugenol.
padrão interno.
Idealmente as curvas de calibração
não foi observado para as curvas obtidas.
deveriam ar pela origem, porém, isso
Desta forma, levou-se em consideração o
valor dos desvios referentes a cada
valores dos coeficientes lineares foram
parâmetro
considerados
das
(coeficientes fornecido
pelo
equações
lineares
e
das
retas
estatisticamente
não
angulares),
significativos para as duas curvas, não
software utilizado na
sendo utilizados nas equações das retas
confecção dos gráficos, para avaliar a
para os cálculos das concentrações. [3]
significância dos mesmos (Tabela 5). Para
A análise da amostra extraída do
que o parâmetro seja estatisticamente
cravo-da-índia foi feita em replicata por
significativo, a razão entre o valor do
quatro analistas, o que é um procedimento
parâmetro e o desvio deve ser maior que o
comum nos casos em que a prática é
valor tabelado para o t de Student. Em um
realizada por uma equipe e onde todos
modelo linear, o número de graus de
devem participar. A Tabela 6 mostra os
liberdade (GL) é dado por GL= N - 2, onde
resultados
N é o número de pontos da curva. Para um
levando em consideração os dois tipos de
limite de confiança de 95%, o t de Student
calibração. [3]
obtidos
por
cada
analista
tabelado é igual a 3,182; desta forma, os Tabela 5 – Análise estatística de significância dos parâmetros das curvas
Tabela 6 – Resultados obtidos com diferentes analistas
Por análise de variância one-way
calibração, Tabela 7, foi possível constatar
dos resultados obtidos para os dois tipos de
que as médias das duas metodologias são
significativamente diferentes a um nível de confiança de 95%.
[3]
manuseio do operador do método de
Assim sendo, através desta prática foi
possível
demonstrar
a erros na medida de volume e de
a
calibração externa. Os desvios relativos
pouca
para o cálculo de eugenol na amostra com
reprodutibilidade que existe nos resultados
a calibração externa e interna foram de
quando vários analistas estão envolvidos
6,272 e 0,673%, respectivamente. O
na injeção de uma amostra com fins
percentual de eugenol obtido no óleo
quantitativos na técnica de cromatografia
através da calibração do padrão interno foi
gasosa e, principalmente, que a utilização
compatível com o valor apresentado na
de padronização interna infere um desvio
literatura (70 a 90%)3, enquanto que para a
muito menor nos resultados (Tabela 8).
calibração externa o valor encontrado foi
Este fato indica uma maior suscetibilidade
inferior ao esperado. [3]
Tabela 7 - Resultados da ANOVA para as duas calibrações
Tabela 8 - Comparação entre as diferentes calibrações
4.2 - Padronização do óleo de copaíba por cromatografia em fase gasosa de alta resolução
Resultados e Discussão
Para desenvolvimento do método
detector por ionização em chama é quase
de análise quantitativo, a padronização
constante para substâncias de mesma
interna
classe, principalmente aquelas de alto peso
com
natureza
substâncias
química
de
implicaria
mesma um
molecular, as concentrações de outros
número reduzido de análises. No entanto, o
sesquiterpenos abundantes também podem
cromatograma
copaíba
ser determinadas por intermédio do uso do
apresenta-se, em geral, muito complexo
trans-(-)-cariofileno. O mesmo estudo foi
quanto ao número de sinais registrados
realizado com o padrão de ácido copálico
dada a extensa variedade de espécies
isolado do óleo, com o intuito de comparar
terpênicas
os resultados obtidos pelas duas vias de
do
presentes,
óleo
de
em
inviabilizando
o
emprego do método de padronização
quantificação. [4]
interna. Por isso, foi investigada a técnica de padronização externa com um padrão
Linearidade e faixa de resposta do padrão
comercial de trans-(-)-cariofileno. Este foi selecionado por ser um hidrocarboneto sesquiterpênico de presença ubíqua nas amostras descritas de óleo de copaíba (e também na maioria das misturas voláteis de origem vegetal) e comercialmente disponível como um padrão analítico de elevada pureza. Uma vez que a resposta do
A Tabela 9 apresenta os dados relativos às curvas analíticas para os padrões de sesquiterpeno e do ácido diterpênico triplicatas padrão,
metilado, das
com
injeções o
obtidas das
mínimo
com
soluções de
cinco
concentrações, conforme recomendado por órgãos reguladores. [4]
Tabela 9 - Dados da curva analítica para o trans-(-)-cariofileno e o éster metílico do ácido copálico
Análi ses realizadas em triplicatas. Os coeficientes
lineares não
diferiram estatisticamente (P < 0,05) de
analito. O método proposto demonstrou ser
zero.
seletivo, não sendo afetado pelos outros Dentro da faixa de concentração
estudada para os padrões, foi encontrada a
constituintes da matriz ou por interferentes dos reagentes e solventes. [5]
faixa linear de resposta do detector, a partir da qual foi estabelecido o limite mínimo
Linearidade
em que as substâncias puderam ser quantificadas com exatidão e precisão
Para a quantificação empregou-se o
aceitáveis (Tabela 2). Visto que os
método da padronização externa, visando
coeficientes lineares das curvas analíticas,
obter análises com menores custo e tempo
tanto para o ácido copálico como para o
de análise. A linearidade de um método
trans-(-)-cariofileno
diferem
mostra quanto os resultados obtidos são
estatisticamente de zero (P < 0,05), a
diretamente proporcionais à concentração
quantificação
do
não
de
sesquiterpenos
e
diterpenos foi realizada por normalização e
analito,
dentro
de
um
intervalo
especificado. [5]
comparação direta da respectiva solução
Os valores das áreas dos picos das
padrão com a área do analito em questão.[4]
soluções de CAP silanizado versus as respectivas concentrações foram utilizados
4.3
-
Otimização
Intralaboratorial
de
e
Validação
Método
Para
Análise de Resíduos de Cloranfenicol em Leite
Caprino
por
Cromatografia
Gasosa com Detecção Por Captura de Elétrons (CG/DCE)
para aplicar a regressão linear via método dos mínimos quadrados. A curva analítica obtida por padronização externa com cinco níveis de calibração injetados em triplicata no CG/DCE resultou uma equação de reta (y = 5200,3x - 382,43) com coeficiente de determinação (R2) de 0,998 (Figura 9). De
Validação do método analítico
acordo com os critérios de aceitabilidade dos
Seletividade
resultados,
o
coeficiente
de
determinação da curva analítica (R2) deve De acordo com os cromatogramas
ser 0,995. Os valores de linearidade
do branco da matriz, do padrão de CAP
obtidos
silanizado
fortificada,
quantificação por padronização interna são
evidencia-se a seletividade do método, pela
similares (Tabela 10). Portanto, o valor do
ausência da detecção de picos no tR do
coeficiente de determinação obtido por
e
da
matriz
por
métodos
que
fazem
a
padronização externa (0,998) é satisfatório. [5]
Figura 9 - Curva analítica de CAP silanizado (área x concentração em μg/kg) obtida por CG/DCE. y = 5200,3x – 382,43 e R2 = 0,998. Tabela 10 - Comparação entre os parâmetros de validação obtidos pelo presente método para leite caprino e os valores encontrados na literatura para leite bovino Ref. Este estudo 24 23 26 27
Técnica Aplica a CG/DCE
Extração
CG/DCEa CG/EM/EMb CL/EM/EMc CL/EM/EMc
28
CL/EM/EMc
29 30
CL/EM/EM CL/EM/EMc
31
CL/EM/EMc
39
CL/EMd
48
CL/EM
c
d
Acetato de Etila Acetonitrila Acetonitrila Acetonitrila Acetato de Etila Acetato de Etila Acetonitrila Ácido tricloacético 10% SPE C18
Tampão Fosfato pH 4.0 Acetonitrila
Purificação
R2
LOD
LOQ
CCα
CCβ
(µg/L)
(µg/L)
(µg/L)
(µg/L)
0,030
0,10
0,083 0,11 0,090
0,14 0,15 0,11
Não utilizou 0,980
0,050
0,090
Não utilizou 0,999 SPE HLB 0,999
0,020 0,020
0,040 0,030
SPE C18
0,998
SPE C18 SPE C18 SPE C18 Não utilizou
0,9995 1,0 0,979 0,9605 0,998
5,0
Óxido Neutro de Alumínio PMNE
0,9999
0,030
0,998
0,040
0.14
SPE LMS
0,999
050
1.0
a
Cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons;
b
cromatografia gasosa com
c
detecção por espectrometria de massas em tandem; cromatografia líquida com detecção por espectrometria de massas em tandem;
d
cromatografia líquida com detecção por
espectrometria de massas; e micro-extração com polímero monolítico; - dados não fornecidos.[5] Limites de detecção e quantificação
métodos que utilizam CL e CG associados
O LOD determinado através da razão entre sinal:ruído (3:1) foi de 0,030 mg/kg, e o LOQ determinado pela relação
Métodos que utilizam as técnicas de e
CG/EM/EM
para
a
determinação de resíduos de CAP em leite bovino apresentam limites de decisão (CCα) e capacidades de detecção (CCβ) nas faixas de 0,020 a 0,11 µg/kg e de 0,030 a 0,15 µg/kg, respectivamente (Tabela 10). Métodos utilizando a técnica de CL/EM também
para a matriz
leite
massas. [5] Comparando-se os dados de LOD e LOQ obtidos neste estudo com os dados da
sinal:ruído (10:1) foi de 0,10 mg/kg. [05]
CL/EM/EM
com as técnicas de espectrometria de
bovino
resultaram em um LOD entre 0,040 e 0,50 μg/kg e LOQ de 0,14 a 1,0 μg/kg. Vale ressaltar que estes métodos empregaram procedimentos de extrações diferentes dos utilizados no presente estudo, assim como etapas de purificação distintas ou ausentes (Tabela 10). Estas diferenças podem ter influenciado na recuperação do analito e, consequentemente, a sensibilidade dos métodos. [5] Portanto, nota-se que o emprego do CG/DCE nas condições utilizadas no presente método de validação permite atingir níveis de sensibilidade próximos a
única referência encontrada que utilizou a técnica de CG/DCE para a determinação de CAP em leite bovino (Tabela 10), observa-se que os LOD e LOQ obtidos no presente estudo (0,030 e 0,10 μg/kg) são cerca de 30 vezes maiores para o LOD e 50 vezes maiores para o LOQ. Uma vez que as matrizes de leites bovinos e caprinos possuem
semelhanças
na
composição
centesimal, esta diferença de sensibilidade pode ser devida aos distintos procedimentos de extração das amostras, tais como, não remoção da fração lipídica, que pode resultar em um aumento no nível de interferentes e, a utilização de água para retomar o extrato seco anterior à etapa de purificação por SPE-C18, que pode ter reduzido a recuperação do resíduo e a sensibilidade do método, considerando que o CAP tem baixa solubilidade neste solvente. [5]
5.0 - Vantagens A
Cromatografia
com
Fluidos
Supercríticos (SFC) foi desenvolvida a partir
do
conhecimento
já
bem
sedimentado da cromatografia gasosa (GC) e da cromatografia líquida (LC).[12] São citadas algumas vantagens ao utilizar a
Os solventes usados, geralmente, à
pressão
normal
e
temperatura ambiente. Isso significa, que, após a extração, eles podem ser facilmente eliminados de ambos, dos resíduos de extração e dos produtos extraídos e
A maioria dos gases utilizados são
Com muitos gases, a separação de
materiais é feita a baixas temperaturas, o que é extremamente importante quando se
gases
As
isso
representam
propriedades comprimidos
solventes
dos
podem
ser
apropriado da temperatura e da pressão quanto pela introdução de agentes aditivos que mudem a polaridade dos gases. Em pela
o
material
original;
A força solvente é ajustada via
difundibilidade
do
soluto,
solventes líquidos;
Com a adição de cossolventes,
permite-se a extração diferencial de solutos não polares até solutos de polaridade alta;
Não permanece solvente residual
nos extratos obtidos por fluido supercrítico
aumenta a solubilidade do material a ser
alteração
Outra vantagem é que o gás
carbônico é um material inerte, não inflamável e, como solvente, depois da
Os solventes podem ser reusados, o que significa um baixo custo operacional. [011] A
grandemente variadas, tanto pelo ajuste
adição,
melhor
água, é o de menor custo;
extraem substâncias naturais;
caramelização ou alterações térmicas, por
extraído;
fisiologicamente seguros e inertes;
esterificação,
e a adição de cossolventes orgânicos
recuperados;
oxidação,
consideravelmente maior do que a dos
da extração supercrítica, as principais são:
gasosos
hidrólise,
Das muitas vantagens particulares
são
Os extratos quase não sofrem
compressão mecânica;
cromatografia com Fluidos Supercríticos.
gradual
da
temperatura e da pressão, podem ser feitas extrações multifase e fracionamento do extrato, nos produtos desejados;
análise
de
pesticidas
tem
recebido grande atenção recentemente, devido
ao
impacto
ambiental
e
à
necessidade de monitorar traços de seus metabólitos em amostras complexas de alimentos. Geralmente a cromatografia gasosa é escolhida como o método analítico, devido a sua alta sensibilidade e disponibilidade de detectores seletivos
(fotométrico de chama, nitrogênio-fósforo
160,000.00 e processa somente 5,0 litros
e, principalmente, o detector por captura de
por vez. Uma unidade industrial não sai
elétrons).
[13]
por menos de $ 1,000,000.00 e processa 450 litros de cada vez. Assim, produtos de
6.0 – Desvantagens
baixo valor agregado e baixo rendimento não podem ser economicamente extraídos
O processo torna-se caro devido ao
por esse processo. Ainda, compostos muito
custo dos equipamentos. A unidade de
polares, dificilmente serão extraídos sem a
teste (Figura 4), pertencente à White
adição de um cossolvente adequado. [11]
Martins S.A., tem um custo estimado em $
Figura 10 - Aparelho de extração por fluido supercrítico ES-204. 7.0 – Perspectivas Futuras
possibilidades que o processo oferece,
As perspectivas do emprego da extração supercrítica relacionadas com os resultados
das
pesquisas
em
desenvolvimento dão maior consciência aos demais profissionais da área sobre as
sobre
sua
viabilidade
econômica,
disseminação dos atuais conhecimentos sobre o assunto, escolha das matériasprimas mais adequadas, necessidade de obter
produtos
isentos
de
solventes
orgânicos, as restrições cada vez mais
presentes ao uso dos solventes orgânicos
observação e assimilação dos principais
tóxicos, necessidade de fracionamentos de
fatores
óleos essenciais sem quebra de moléculas e
quantitativa na cromatografia gasosa e as
obtenção
aos
diferenças entre as calibrações, os erros
existentes na natureza, são adequadas para
que podem ocorrer, e os procedimentos
a
necessários para minimizá-los através do
de
indústria
produtos
alimentícia,
idênticos
cosmética
e
farmacêutica. [11]
que influenciam
uma análise
uso de padrão interno. Este trabalho de
O número de aplicações potenciais
modo geral tratou de diferentes processos
da extração por fluidos supercríticos,
cromatográficos, fases que podem ser
continua a crescer em todo o mundo. Pelo
utilizadas
que se verifica, sua aplicação já é uma
cromatográficas
realidade, em parte impulsionada pela
cromatografia.
demanda crescente de produtos de alta
para
trabalhos
também
cromatografia
comércio
de
insumos
e
os
técnicas tipos
de
Os resultados e discussões dos
qualidade e da globalização da economia, no
realizar
analisados
deram
gasosa
por
ênfase ser
a
muito
farmacêuticos, alimentícios, químicos e
utilizada e ser apropriada para alcançar os
cosméticos
resultados desejados. A menos utilizada de
e
principalmente,
pela
seletividade, facilidade e capacidade de
todas
separação e fracionamento que oferece
supercrítico (SFC), principalmente devido
para um grande número de compostos
ao alto custo dos
orgânicos, muitas vezes impossíveis de
surgimento da SFC ainda é tímido, todavia
extrair pelos processos tradicionais e
ele é inegável. A indústria farmacêutica
aqueles cuja purificação torna-se por
está sendo sua principal promotora por ter
demais onerosa, necessitando de colunas
encontrado nesse método cromatográfico
de alta resolução, nem sempre disponíveis
uma ferramenta analítica particularmente
no mercado nacional.
[11]
é
apropriada
cromatografia
para
com
fluido
equipamentos. O
seus
compostos
de
interesse. Compostos farmacêuticos são, 8.0 – Considerações Finais A
partir
dos
em sua grande maioria, ou compostos experimentos
propostos foi possível proporcionar uma
termicamente
instáveis,
volatilidade
ou
ou
compostos
de
baixa quirais.
9.0 -Referências Bibliográficas [1] – Cromatografia. Disponível em:
(CG/DCE). Revista Química Nova, Vol.
33, n 1, 2010.
tografia>. o em 18 de Julho de 2011. [6] – Cromatógrafo. Disponível em: < [2]
-
Detectores
Gasosa.
de
Cromatografia
Disponível
em:
http://pt.idoub.com/doc/36702414/Cromat ografia-Gasosa-Acoplada-a-
Espectrometro-de-Massas>. o em 15
arigony/cromatografia_FINAL/detectores_
de Agosto de 2011.
cg.htm> o em 15 de Agosto de 2011. [7] - CARRILHO, E.; TAVARES, M. C. [3] – LIGIERO, C. B. P.; REIS, L. A. dos;
H.; LANÇAS, F. M. Fluidos Supercríticos
PARRILHA, G. L.; BAPTISTA FILHO,
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M.; CANELA, M. C. Comparação Entre
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Métodos
Revista Química Nova. Vol. 26, n 5,
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Cromatografia Gasosa: Um Experimento
2003.
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[8] – Injeção. Disponível em:
[4] – TAPPIN, M. R. R.; PEREIRA, J. F.
AZesAB/cromatografia-gasosa>.
G.; Lima, L. A.; SIANI, A. C. Análise
em 15 de agosto de 2011.
Química Quantitativa Para a Padronização do Óleo de Copaíba por Cromatografia em Fase Gasosa de Alta Resolução. Revista Química Nova, Vol. 27, n 2, , 2004. [5] – SILVA, J. R. da; SILVA, L. T.;
o
[09] - Detector por Ionização de Chama. Disponível
em:
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DRUZIAN, J. I. Otimização e Validação –
Intralaboratorial de Método Para Análise
[010]
Detectores.
de Resíduos de Cloranfenicol em Leite
Caprino por Cromatografia Gasosa com
of//files/lucianamelo71/data03-07-
Detecção Por Captura de Elétrons
2009-horas10-34-57.pdf>. o em 15 de Agosto de 2011.
Disponível
em:
[11] – Fluidos supercríticos: situação
com Fluido Supercrítico: Instrumentação.
atual e futuro da extração supercrítica.
Revista Química Nova. Vol. 26, n 5,
Disponível
2003.
em:
. o em 31 de Julho
[13] - CARRILHO, E.; TAVARES, M. C.
de 2011.
H.; LANÇAS, F. M. Fluidos Supercríticos em Química Analítica. III. Cromatografia
[12] - CARRILHO, E.; TAVARES, M. C.
com
Fluido
Supercrítico:
Aplicações.
H.; LANÇAS, F. M. Fluidos Supercríticos
Revista Química Nova. Vol. 29, No. 4,
em Química Analítica. II. Cromatografia
2006.
RESUMO
Atualmente muitas são as técnicas analíticas que podem ser efetuadas em laboratórios com maior praticidade e eficiência com o intuito de obter resultados qualitativos e quantitativos com maior segurança. Uma técnica muito utilizada para separar substâncias é a cromatografia. Esse artigo objetiva mostrar a eficiência, vantagens e desvantagens desse método de separação e quais aspectos positivos fazem com que esse método analítico seja um dos mais utilizados sendo também muito eficiente, considerando que para análise quantitativa de dados dos trabalhos analisados será dada ênfase na cromatografia gasosa.
Palavras-chave: Cromatografia, fase, quantitativa.
ABSTRACT
Currently there are many analytical techniques that can be performed in laboratories with greater convenience and efficiency in order to obtain qualitative and quantitative results with greater security. A widely used technique for separating substances is chromatography. This article aims to show the efficacy, advantages and disadvantages of this method of isolation and positive aspects which make this analytical method is one of the most used is also very efficient, whereas data for quantitative analysis of the studies analyzed emphasis will be placed in gas chromatography .
Keywords: Chromatography, phase, quantitative.
1.0 - Introdução
a técnica para a separação de pigmentos
O termo cromatografia é atribuído
presentes em folhas de plantas, através da
ao botânico russo Mikhael Semenovich
agem de extratos de folhas, arrastados
Tswett que, no início do século empregou
por éter de petróleo, através de leitos de
carbonato de cálcio finamente dividido. As
quantitativa,
espécies separadas (clorofilas e xantofilas)
cromatografia ou em conjunto com outras
apareciam
técnicas
nos
leitos
como
bandas
pela
própria
experimentais,
técnica
tais
de
como
a
coloridas, e por isso Tswett chamou o
espectrofotometria ou a espectrometria de
método de cromatografia, do grego chroma
massas. [1]
(cor) e graphein (escrever).[1]
No que diz respeito à classificação,
A definição de cromatografia dada
os métodos cromatográficos podem ser
pela IUPAC em 1993 é a seguinte:
classificados de duas formas. A primeira,
“cromatografia é o método físico de
mais simples, é baseada na forma pela qual
separação no qual os componentes a serem
as duas fases são colocadas em contato.
separados se distribuem entre duas fases,
Segundo
esse
uma das quais estacionária, enquanto a
poderiam
ser
outra
categorias: [1]
se
movimenta
numa
direção
critério,
os
classificados
métodos em
duas
definida”. A mistura que contém os
cromatografia em coluna, na qual a fase
componentes
é
estacionária é mantida dentro de um tubo,
dissolvida na fase móvel. Durante a
em geral bastante estreito, dentro do qual a
agem da fase móvel através da fase
fase móvel é forçada por efeito de pressão
estacionária,
ou pela efeito da gravidade;
a
serem
alguns
separados
componentes
são
fortemente retidos pela fase estacionária e
cromatografia planar, na qual a fase
por isso se movem lentamente com o fluxo
estacionária é ada numa superfície
da fase móvel; enquanto isso, outros
plana ou nos interstícios de um papel. A
componentes interagem fracamente com a
fase móvel se move através da fase
fase estacionária, sendo transportados mais
estacionária por efeito da capilaridade ou
facilmente pela fase móvel. Devido a essas
da gravidade. Outro critério de classificação, mais fundamental, é baseado nos tipos de fases
diferenças em mobilidade, os componentes
estacionárias e móveis, e nos mecanismos
da
envolvidos nas transferências de solutos
mistura
analisados
podem de forma
ser
separados
e
qualitativa e/ou
entre as fases. [1]
A fase estacionária pode ser sólida
último caso, a fase líquida pode ser
ou líquida. No caso de fase estacionária
chamada de “fase ligada”. A fase móvel
líquida, o líquido pode simplesmente estar
pode ser líquida, gasosa ou um fluído
espalhado sobre um e sólido ou
supercrítico. [1]
então estar imobilizado sobre este. Neste
Os mecanismos que podem estar
1.3 - Troca Iônica: A fase estacionária é
envolvidos em processos cromatográficos
constituída de uma matriz onde são
são mencionados nas Figuras 1.1 a 1.5, a
adicionados grupos funcionais ionizáveis
seguir.
(catiônicos ou aniônicos). A fase móvel é, geralmente, uma solução iônica com 1.1
Waals,
-
Adsorção:
propriedades tamponantes, escolhidas de
Processo baseado em
forma a ser compatível com o tipo de
interações eletrostáticas,
trocador
dipolares
grupos funcionais, ligados quimicamente à
(Van
de
por exemplo) ou pontes de
matriz
usado.
Bioafinidade:
estacionária,
que
utiliza
possuam
hidrogênio, que ocorrem entre grupos ativos presentes na superfície da fase estacionária sólida e a fase móvel. Em processos cromatográficos, a adsorção é sempre reversível (a dessorção do soluto
especificidade biológica. Esses grupos
implica na volta deste à fase móvel). [1]
retiram da fase móvel somente as suas espécies complementares, deixando ar
1.2
-
Quando estacionária
todas as outras espécies. [1]
Partição: a
fase é
um
líquido, espalhado na superfície de um e sólido e inerte ou nas paredes de um tubo, o processo é interfacial, ocorrendo por absorção, ou partição, que se baseia nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionária. [1]
1.4
-
Bioafinidade:
Utiliza
grupos
funcionais,
ligados
quimicamente à matriz estacionária, que possuam especificidade biológica. Esses grupos retiram da fase móvel somente as suas espécies complementares, deixando ar todas as outras espécies. [1]
1.5 - Exclusão: Baseia-se
poros)
em um processo puramente
presentes na fase móvel podem ser
mecânico. A fase estacionária é uma matriz
separados porque os menores são capazes
de
textura
de penetrar facilmente em todos os poros
(superfície e distribuição de tamanhos de
da fase estacionária, equilibrando-se com a
composição
inerte,
com
controlada.
Os
componentes
fase móvel que também entra nos poros,
quimicamente ligadas a um e sólido
enquanto
excluídas,
também podem apresentar um mecanismo
acompanhando a fase móvel que fica fora
de separação que é um compromisso entre
dos poros. As moléculas com tamanho
adsorção (sobre sítios ativos do e
intermediário entre esses dois extremos
sólido) e partição (que ocorre na fase
migram com velocidades variáveis, sendo
líquida
que possuem penetração seletiva nos
contribuição relativa de cada mecanismo
poros, entrando em alguns, mas não em
depende da quantidade relativa de cada
todos. [1]
tipo de grupo funcional existente.
as
maiores
são
A cromatografia vem apresentando crescente
utilização
ligada).
A
Uma
classificação dos métodos cromatográficos,
ferramenta
retirada de Collins et al. (1990), é
analítica devido à sua simplicidade, ao
apresentada na Tabela 1.[1] Tabela 1 -
custo relativamente baixo, à vasta gama de
Classificação
aplicações possíveis e à possibilidade de
cromatográficos, retirada de Collins et al.
fornecer dados quantitativos confiáveis. [1]
(1990)
Processos utilizam
fases
como
quimicamente
cromatográficos estacionárias
dos
métodos
que
líquidas
A análise quantitativa está baseada
aqueles obtidos a partir de um ou mais
na comparação das alturas ou das áreas dos
padrões. Se as condições operacionais
picos
forem bem controladas, esses parâmetros
correspondentes
aos
compostos
presentes nas misturas sob análise com Técnica
(altura
e
PLANAR
Fase Móvel
.
Líquida Sólido Ligada
Tipo de
CCD
dos
picos)
variam
EM COLUNA
Líquida
Fase Estacionária
área
CCD
Gasosa
Fluido Supercrítico
Líquida Sólido Ligada CGL
CGS
Sólido Ligada
CGFL
CSS
CSFL
Líquida Líquida Sólido CLL
Ligada
CLS CE CLFL CTI CB
Cromatografia
Sigla em
Nome da Técnica
Português
Sigla em
Nome da Técnica
Português
Cromatografia em papel
CSFL
Cromatografia supercrítica com fase ligada
CCD
Cromatografia em camada delgada
CLL
Cromatografia líquido-líquido
CCD
Cromatografia em camada delgada
CLS
Cromatografia líquido sólido
CGL
Cromatografia gás-líquido
CE
Cromatografia por exclusão
CGS
Cromatografia gás-sólido
CLFL
Cromatografia líquida com fase ligada
CGFL
Cromatografia gás fase ligada
CTI
Cromatografia por troca iônica
CSS
Cromatografia supercrítica com fase estacionária
CB
Cromatografia por bioafinidade
sólida
linearmente com a composição. [1] Numerosos descritos
para
métodos
detecção
evitar erros comuns experimental, e para
tem
dos
sido
encontrar as melhores maneiras de eliminar
vapores
sua interferência durante a fase de análise
orgânicos eluídos num cromatógrafo a gás.
quantitativa. [3]
Os principais métodos de detenção são classificados
de
acordo
com
Tappin et al., (2004), desenvolveu
as
um trabalho de análise quantitativa com
propriedades físicas que configuram o
Cromatografia Gasosa utilizando Detector
mecanismo de detecção. Os detectores são
por Ionização de Chama GC-FID utilizada
classificados como: universal, seletivo e
para análise de óleos de copaíba metilado,
específico. Os detectores de ionização de
utilizando trans-(-)-cariofileno, ou copalate
chama e condutividade térmica respondem
metilo como padrões externos. Curvas
na presença de todos os compostos
analíticas mostraram boa linearidade e
orgânicos e são portanto considerados
reprodutibilidade em termos de correlação
detectores universais. Outros detectores
de
respondem somente na presença de um
respectivamente) e desvio padrão relativo
heteroátomo em particular (por exemplo,
(<3%). Quantificação de sesquiterpenos e
fotométrico de chama e termoiônico são
ácidos diterpenic foram realizados com
considerados detectores específicos). O de
cada
captura de elétrons é considerado seletivo,
comparado
pois detecta qualquer substância que
resposta integrada, a padronização foi
apresente grupo atômico capaz de captar
estatisticamente semelhante para o caso de
elétrons. [2]
copalate de metila, mas a resposta de trans-
Ligiero et al., (2009), desenvolveu
coeficientes
padrão,
e
separadamente.
com
(-)-cariofileno
(0,9992
a
foi
0,996,
Quando
normalização
da
estatisticamente
um experimento que consistiu na extração
diferente (P <0,05). Este método mostrou-
e análise de eugenol a partir de sementes
se adequado para a classificação e controle
de cravo para realizar uma abordagem
de qualidade de amostras comerciais de
quantitativa, que teve como objetivo
óleos. [4]
comparar
os
por
Silva, Silva e Druzian (2010),
procedimentos de calibração interna e
desenvolveram uma pesquisa no intuito de
externa. Portanto, esta experiência mostrou
pesquisar a existência de um antibiótico
ser ferramenta muito eficaz para aumentar
em leite caprino que pode ser nocivo à
a
população.
consciência
resultados
dos
obtidos
alunos
sobre
a
Os
antibióticos
e
outros
necessidade de compreender os diferentes
medicamentos istrados em animais
tipos de calibração no GC e sobre como
podem caracterizar perigos relacionados ao
risco de intoxicações de origem alimentar
na população. O presente trabalho consiste
para os humanos. Devido a isto, o
na otimização e validação de metodologia
monitoramento
de
analítica para determinação de resíduos de
medicamentos veterinários em alimentos
cloranfenicol em leite de cabra por GC /
tornou-se
preocupação
ECD. A extração foi feita com acetato de
constante dos consumidores, órgãos regu-
etila e do clean-up com o SPE-C18. A
ladores e instituições de pesquisa. A
identificação foi feita por comparação do
presença de resíduos de cloranfenicol em
tempo
leite de cabra pode causar efeitos tóxicos
quantificação por padronização externa. [5]
uma
dos
área
resíduos
de
de
retenção
e
GC/MS,
2.0 – Esquema de Cromatógrafo
Figura 2 – Esquema de Cromatógrafo Gasoso. [6] 2.1 – Sistema de bombeamento e pressurização A tabela 2 apresenta características de sistemas de bombeamento e pressurização. [7]
Tabela 2. Características de três tipos de sistemas de pressurização
ea
Tipo
de
Funcionamento
Vantagens
Limitações
Uso
pressurização
um líquido em um
é a opção mais fácil e barata
este sistema é bastante
se o sistema
pneumática
recipiente metálico é
de se implementar em um
limitado, uma vez que
disp
pressurizado
laboratório, pois o vaso de
amaior pressão disponível
de uma boa válvula
diretamente com
pressurização pode ser
de se obter é igual à
de alta pressão, a
nitrogênio (ou outro
construído em uma oficina
do cilindro de nitrogênio
programação de
gás inerte)
mecânica simples
(aproximadamente 160
pressão é possível,
bar)
podendo ser
Bomba
efetuados incrementos contínuos pistão
é uma bomba típica de
sistema
amplamente
reciprocante
HPLC; funciona com
utilizado
um ou dois pistões de
possível
pequeno volume que
satisfatoriamente a pressão
eletrônico ou mecânico,
ambiente, nenhuma
alternadamente puxam
e operar facilmente com
para
um
modificação
o líquido do
programação
bombeamento
de
necessária,
reservatório e o
composição de fase móvel
comprimem em direção
e/ou
à coluna cromatográfica
modificadores
em
HPLC;
existe a necessidade de
é
instalação
controlar
supressor
de
adição
de de
se
se um
pulso,
obter livre
pulsação
o
fluido
for
líquido
à
temperatura
é porém
se o fluido for um
de
gás,
então
é
necessário refrigerar a bomba
seringa
funciona
funciona
como
um
é a mais indicada para o
sem dúvida, a bomba
a
pistão
uso em SFC pois apresenta
seringa é a opção de
preenchida com o
único, porém de grande
fluxo
rápida
melhor desempenho por
fluido
volume (~20 mL)
resposta à programação e
ser livre de pulsação e por
composição a ser
permite também a utilização
atingir
usado, podendo ser
de
fluido
porém também é a de
usado
que
maior custo e não permite
vazão ou pressão
estejam no estado líquido
mudança
constantes ou com
(para
composição de fase móvel
estável,
gases
como
supercrítico,
tal
desde
é
necessário
altas
pressões,
rápida
de
resfriar o sistema antes da
seringa
é
na
tanto
gradiente
com
de
densidade
pressurização)
2.2 Injetores Vários autores pioneiros chegaram
descreveram um sistema onde a amostra
a construir seus próprios injetores. Jentoft e
era injetada pneumaticamente para dentro
Gouw montaram um injetor de alta pressão
da
do tipo “stop flow”. Sie e Rijnders
desenvolvidos sistemas de injeção de
coluna.
Atualmente
estão
sendo
amostras para alta pressão baseados no
apresentadas algumas relações de volume
tempo, os quais possibilitam a injeção de
de injeção em função do diâmetro e
volumes bastante reduzidos com alta
comprimento da coluna. [7]
precisão e exatidão. Na Tabela 3 são
Tabela 3. Volumes típicos de injeção (Vinj) em função do diâmetro interno (d.i.) e comprimento (L) da coluna capilar. [7]
Diâmetro interno Volume do injetor Comprimento da coluna d.i. (μm)
Vinj (μL)
L (m)
200
1,50
4,8
100
0,27
3,4
50
0,05
2,4
Injetores: Seringas
Firgura 3 – Injeção com seringas. [8] 2.3 - Colunas Um
resumo
das
vantagens
e
desvantagens do uso das colunas capilares
e empacotadas é apresentado na Tabela 4.[7]
Tabela 4. Resumo das características do emprego das colunas capilares e empacotadas [7]
Coluna capilar Vantagens: • Baixa queda de pressão • Alta eficiência • Facilidade de interface com detectores FID e MS • Baixa vazão de fase móvel (bomba seringa) Desvantagens: • Baixa velocidade ótima • Difícil controle de vazão • Baixa sensibilidade com detectores UV e IR Coluna empacotada Vantagens: • Menor tempo de análise • Alta capacidade de amostra (sensibilidade) • Possibilidade de uso de detectores UV e IR Desvantagens: • Alta queda de pressão • Baixa eficiência • Grande área superficial (possível efeito de adsorção)
2.4 – res
Os res são usados para que se
tipos de res: r de sílica
mantenha a pressão homogênea dentro da
fundida, r de sílica fundida não
coluna cromatográfica. res mais
tratada, r de aço inox, r de
simples são constituídos de tubo de sílica
vidro Pyrex e r de filtro sinterizado
fundida de pequeno diâmetro interno (<10
microporoso, tendo obtido um melhor
μm) como o utilizado por McNair e
resultado com o primeiro. [7]
Hensley. Bertsch e Green compararam 5
Figura 4 - Diagrama de vários res que podem ser usados para SFC. A)de sílica fundida com redutor, B) de sílica fundida com extremidade cônica, C) e D) de sílica fundida com diferentes diâmetros de orifício, E) de sílica fundida com orifício interno formado a partir da compressão da coluna à temperatura elevada, F) formado pela deposição de material no final do capilar, G) de orifício tipo “pinhole”, muito usado para SFC-MS, H) de sílica fundida formada por filtro poroso (“frit”), I) r com a extremidade comprimida (“pinched”). 3.5 – Detectores
Destrutivos/não destrutivos; Os
Classificados quanto a seletividade: Universais, Seletivos ou Específicos. Características desejáveis:
detectores
utilizados
nas
pesquisas mostradas neste trabalho são os detectores por ionização de chama. Um detector de ionização de chama
Sensibilidade elevada;
(FID ou DIC) consiste em uma chama de
Baixo nível de ruído;
hidrogênio (H2)/ ar e um prato coletor. O
Resposta para os compostos de interesse
efluente a da coluna do CG através da
(universais, seletivos e específicos);
chama, a qual divide em moléculas
Ampla faixa de linearidade;
orgânicas e produz íons. Os íons são
Quantidade mínima detectada;
recolhidos em um eletrodo negativo e
Insensível a pequenas mudanças de
produzem um sinal elétrico. O FID é
fluxo e temperatura;
extremamente sensível com uma faixa
dinâmica grande. Sua única desvantagem é
(He2) ou hidrogênio mais nitrogênio (N2).
que
amostra.
Os íons e elétrons que se formaram na
Os detectores por ionização de chama são
chama ficam presos em um eletrodo
usados para detectar hidrocarbonetos (HC)
permitindo que uma corrente flua no
como o metano (CH4), etano (C2H6),
circuito externo. A corrente é proporcional
acetileno (C2H2), etc. [9]
aos íons formados, o que depende da
Alta sensibilidade: determinações até
concentração de hidrocarbonetos nos gases
-13
e é detectada por um eletrômetro e
10
destrói
a
g/mL.
mostrada na saída análoga. [9]
Simplicidade.
Gás de arraste: estabilidade térmica e
inércia química
Hidrogênio,
Helio e
Nitrogênio.
O FID oferece uma leitura rápida, precisa e contínua da concentração total de HC para níveis tão baixos como ppb.
[9]
A amostra a ser analisada mistura-se com hidrogênio (H2), hidrogênio mais hélio 3.0 – Áreas de aplicação
desenvolvimentos de processos para a indústria
farmacêutica,
de
alimentos,
cosmética, de engenharia de alimentos, de perfumaria
e
para
as
indústrias
de
processamento químico, com as seguintes finalidades: [11]
Preparação
representam componentes
de
mais
extratos
que
fielmente
os
das
matérias-primas
originais, tanto do aspecto químico quanto do ponto de vista sensorial;
Figura 5 – Detector por ionização de chama.
Isolamento,
remoção,
e/ou
concentração de princípios ativos naturais,
[10]
tais
como:
antioxidantes,
corantes,
constituintes organolepticamente idênticos, constituintes Pelo processo da extração por fluido supercrítico, podem ser feitos
fitoterápicos
e
produtos
indesejáveis, como a nicotina, a cafeína e certos componentes tóxicos;
Extração
de
matérias-primas
e
fármacos de fontes botânicas;
Processamento
de
produtos
Extração de derivados da lignite;
Extração
de
hidrocarbonetos
líquidos do carvão de pedra e da hulha;
sanitários e suplementos alimentícios;
plantas aromáticas, etc. [011]
Produção de uma variedade de
oleorresinas
de
condimentos
de
Extração de óleos essenciais de
alta
De forma geral CG e aplicável para
qualidade;
separação e análise de misturas cujos
Purificação de polímeros;
constituintes tenham pontos de ebulição de
Extração
e
refino
de
óleos
até 300oC e que são termicamente estáveis.
comestíveis;
[10]
Concentração de óleos cítricos;
Extração e fracionamento de óleos
•
Análise de ácidos graxos e triglicerídeos; Análise
de
compostos
voláteis
de sementes e ácidos graxos;
responsáveis pelo aroma característico de
alimentos;
Extração de aromas e constituintes
cosméticos;
• Análise de açucares;
• Análise de amino ácidos;
Extração de inseticidas naturais de
plantas;
• Análise de pesticidas;
• Separação de pesticidas de amostra de
Extração dos corantes da páprica,
cúrcuma, urucum, genipapo, tagetes e
vinho;
pimentas vermelhas;
• Análise de fármacos e etc. [10]
Extração da lecitina pura da lecitina 4.0 – Análise Quantitativa a partir da
bruta;
Separação do colesterol da gema de
Cromatografia Gasosa
ovo, de gorduras animais e de carnes;
Extração
rápida
de
produtos
Para quantificação de dados foi utilizada a
naturais, como café, lúpulo, cafeína,
cromatografia
lipídios;
trabalhos
Separação
de
aromáticos
de
produtos do petróleo;
Remoção de metais do resíduo do
petróleo;
4.1 - Obtenção do óleo de cravo-da-índia
gasosa,
foram
pois,
desenvolvidos
muitos dando
ênfase a esse tipo de cromatografia considerada muito eficiente.
1,8 mL min-1. O volume de injeção foi de 1 μL. Os tratamentos estatísticos e a
Condições cromatográficas
As análises cromatográficas foram
geração dos gráficos foram feitos no software Origin 7. [3]
Resultados e Discussão
realizadas em um cromatógrafo a gás acoplado a um detector de ionização em chama (CG-DIC) modelo Shimadzu 17A, utilizando uma coluna DB-1 J&W de 30 m, diâmetro interno 0,25 mm e espessura do filme de 0,25 μm. A temperatura do injetor e do detector foram mantidas em 200 e 230 oC, respectivamente, e a programação do forno foi de 50 até 230 oC com uma taxa de aquecimento de 15 oC min-1. O gás carregador utilizado foi o hidrogênio com uma vazão na coluna de
A Figura 6 mostra o cromatograma obtido a partir da injeção de um dos padrões. Os sinais com tempos de retenção de 5,32 e 6,29 min referem-se à carvona (padrão
interno)
e
ao
eugenol,
respectivamente. É possível observar na figura que a resolução obtida permitiu a separação completa dos dois componentes, não havendo sobreposição dos picos cromatográficos. Os valores obtidos para as áreas dos padrões e a razão entre as áreas são apresentados na Tabela 4. [3]
Figura 6 - Cromatograma do padrão contendo eugenol e carvona.
Tabela 4. Resultados das injeções dos padrões
A curva de calibração direta, Figura
significativa entre os dados. Já a curva para
7, foi obtida através de um gráfico da
calibração interna, Figura 8, foi construída
concentração de eugenol versus a área dos
usando a concentração de eugenol versus a
respectivos sinais. O valor do coeficiente
razão entre as áreas dos sinais de eugenol e
de correlação linear (R) de 0, 97007, maior
carvona de cada solução-padrão. O valor
que o valor crítico tabelado de Pearson
de R= 0, 99867 mostra que a correlação
para N= 5 (N é o número de pontos da
linear para este caso foi mais significativa
curva)
que para a curva anterior. [3]
indica
uma
correlação
linear
Figura 7 – Curva de calibração externa do
Figura 8 – Curva de calibração utilizando
Eugenol.
padrão interno.
Idealmente as curvas de calibração
não foi observado para as curvas obtidas.
deveriam ar pela origem, porém, isso
Desta forma, levou-se em consideração o
valor dos desvios referentes a cada
valores dos coeficientes lineares foram
parâmetro
considerados
das
(coeficientes fornecido
pelo
equações
lineares
e
das
retas
estatisticamente
não
angulares),
significativos para as duas curvas, não
software utilizado na
sendo utilizados nas equações das retas
confecção dos gráficos, para avaliar a
para os cálculos das concentrações. [3]
significância dos mesmos (Tabela 5). Para
A análise da amostra extraída do
que o parâmetro seja estatisticamente
cravo-da-índia foi feita em replicata por
significativo, a razão entre o valor do
quatro analistas, o que é um procedimento
parâmetro e o desvio deve ser maior que o
comum nos casos em que a prática é
valor tabelado para o t de Student. Em um
realizada por uma equipe e onde todos
modelo linear, o número de graus de
devem participar. A Tabela 6 mostra os
liberdade (GL) é dado por GL= N - 2, onde
resultados
N é o número de pontos da curva. Para um
levando em consideração os dois tipos de
limite de confiança de 95%, o t de Student
calibração. [3]
obtidos
por
cada
analista
tabelado é igual a 3,182; desta forma, os Tabela 5 – Análise estatística de significância dos parâmetros das curvas
Tabela 6 – Resultados obtidos com diferentes analistas
Por análise de variância one-way
calibração, Tabela 7, foi possível constatar
dos resultados obtidos para os dois tipos de
que as médias das duas metodologias são
significativamente diferentes a um nível de confiança de 95%.
[3]
manuseio do operador do método de
Assim sendo, através desta prática foi
possível
demonstrar
a erros na medida de volume e de
a
calibração externa. Os desvios relativos
pouca
para o cálculo de eugenol na amostra com
reprodutibilidade que existe nos resultados
a calibração externa e interna foram de
quando vários analistas estão envolvidos
6,272 e 0,673%, respectivamente. O
na injeção de uma amostra com fins
percentual de eugenol obtido no óleo
quantitativos na técnica de cromatografia
através da calibração do padrão interno foi
gasosa e, principalmente, que a utilização
compatível com o valor apresentado na
de padronização interna infere um desvio
literatura (70 a 90%)3, enquanto que para a
muito menor nos resultados (Tabela 8).
calibração externa o valor encontrado foi
Este fato indica uma maior suscetibilidade
inferior ao esperado. [3]
Tabela 7 - Resultados da ANOVA para as duas calibrações
Tabela 8 - Comparação entre as diferentes calibrações
4.2 - Padronização do óleo de copaíba por cromatografia em fase gasosa de alta resolução
Resultados e Discussão
Para desenvolvimento do método
detector por ionização em chama é quase
de análise quantitativo, a padronização
constante para substâncias de mesma
interna
classe, principalmente aquelas de alto peso
com
natureza
substâncias
química
de
implicaria
mesma um
molecular, as concentrações de outros
número reduzido de análises. No entanto, o
sesquiterpenos abundantes também podem
cromatograma
copaíba
ser determinadas por intermédio do uso do
apresenta-se, em geral, muito complexo
trans-(-)-cariofileno. O mesmo estudo foi
quanto ao número de sinais registrados
realizado com o padrão de ácido copálico
dada a extensa variedade de espécies
isolado do óleo, com o intuito de comparar
terpênicas
os resultados obtidos pelas duas vias de
do
presentes,
óleo
de
em
inviabilizando
o
emprego do método de padronização
quantificação. [4]
interna. Por isso, foi investigada a técnica de padronização externa com um padrão
Linearidade e faixa de resposta do padrão
comercial de trans-(-)-cariofileno. Este foi selecionado por ser um hidrocarboneto sesquiterpênico de presença ubíqua nas amostras descritas de óleo de copaíba (e também na maioria das misturas voláteis de origem vegetal) e comercialmente disponível como um padrão analítico de elevada pureza. Uma vez que a resposta do
A Tabela 9 apresenta os dados relativos às curvas analíticas para os padrões de sesquiterpeno e do ácido diterpênico triplicatas padrão,
metilado, das
com
injeções o
obtidas das
mínimo
com
soluções de
cinco
concentrações, conforme recomendado por órgãos reguladores. [4]
Tabela 9 - Dados da curva analítica para o trans-(-)-cariofileno e o éster metílico do ácido copálico
Análi ses realizadas em triplicatas. Os coeficientes
lineares não
diferiram estatisticamente (P < 0,05) de
analito. O método proposto demonstrou ser
zero.
seletivo, não sendo afetado pelos outros Dentro da faixa de concentração
estudada para os padrões, foi encontrada a
constituintes da matriz ou por interferentes dos reagentes e solventes. [5]
faixa linear de resposta do detector, a partir da qual foi estabelecido o limite mínimo
Linearidade
em que as substâncias puderam ser quantificadas com exatidão e precisão
Para a quantificação empregou-se o
aceitáveis (Tabela 2). Visto que os
método da padronização externa, visando
coeficientes lineares das curvas analíticas,
obter análises com menores custo e tempo
tanto para o ácido copálico como para o
de análise. A linearidade de um método
trans-(-)-cariofileno
diferem
mostra quanto os resultados obtidos são
estatisticamente de zero (P < 0,05), a
diretamente proporcionais à concentração
quantificação
do
não
de
sesquiterpenos
e
diterpenos foi realizada por normalização e
analito,
dentro
de
um
intervalo
especificado. [5]
comparação direta da respectiva solução
Os valores das áreas dos picos das
padrão com a área do analito em questão.[4]
soluções de CAP silanizado versus as respectivas concentrações foram utilizados
4.3
-
Otimização
Intralaboratorial
de
e
Validação
Método
Para
Análise de Resíduos de Cloranfenicol em Leite
Caprino
por
Cromatografia
Gasosa com Detecção Por Captura de Elétrons (CG/DCE)
para aplicar a regressão linear via método dos mínimos quadrados. A curva analítica obtida por padronização externa com cinco níveis de calibração injetados em triplicata no CG/DCE resultou uma equação de reta (y = 5200,3x - 382,43) com coeficiente de determinação (R2) de 0,998 (Figura 9). De
Validação do método analítico
acordo com os critérios de aceitabilidade dos
Seletividade
resultados,
o
coeficiente
de
determinação da curva analítica (R2) deve De acordo com os cromatogramas
ser 0,995. Os valores de linearidade
do branco da matriz, do padrão de CAP
obtidos
silanizado
fortificada,
quantificação por padronização interna são
evidencia-se a seletividade do método, pela
similares (Tabela 10). Portanto, o valor do
ausência da detecção de picos no tR do
coeficiente de determinação obtido por
e
da
matriz
por
métodos
que
fazem
a
padronização externa (0,998) é satisfatório. [5]
Figura 9 - Curva analítica de CAP silanizado (área x concentração em μg/kg) obtida por CG/DCE. y = 5200,3x – 382,43 e R2 = 0,998. Tabela 10 - Comparação entre os parâmetros de validação obtidos pelo presente método para leite caprino e os valores encontrados na literatura para leite bovino Ref. Este estudo 24 23 26 27
Técnica Aplica a CG/DCE
Extração
CG/DCEa CG/EM/EMb CL/EM/EMc CL/EM/EMc
28
CL/EM/EMc
29 30
CL/EM/EM CL/EM/EMc
31
CL/EM/EMc
39
CL/EMd
48
CL/EM
c
d
Acetato de Etila Acetonitrila Acetonitrila Acetonitrila Acetato de Etila Acetato de Etila Acetonitrila Ácido tricloacético 10% SPE C18
Tampão Fosfato pH 4.0 Acetonitrila
Purificação
R2
LOD
LOQ
CCα
CCβ
(µg/L)
(µg/L)
(µg/L)
(µg/L)
0,030
0,10
0,083 0,11 0,090
0,14 0,15 0,11
Não utilizou 0,980
0,050
0,090
Não utilizou 0,999 SPE HLB 0,999
0,020 0,020
0,040 0,030
SPE C18
0,998
SPE C18 SPE C18 SPE C18 Não utilizou
0,9995 1,0 0,979 0,9605 0,998
5,0
Óxido Neutro de Alumínio PMNE
0,9999
0,030
0,998
0,040
0.14
SPE LMS
0,999
050
1.0
a
Cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons;
b
cromatografia gasosa com
c
detecção por espectrometria de massas em tandem; cromatografia líquida com detecção por espectrometria de massas em tandem;
d
cromatografia líquida com detecção por
espectrometria de massas; e micro-extração com polímero monolítico; - dados não fornecidos.[5] Limites de detecção e quantificação
métodos que utilizam CL e CG associados
O LOD determinado através da razão entre sinal:ruído (3:1) foi de 0,030 mg/kg, e o LOQ determinado pela relação
Métodos que utilizam as técnicas de e
CG/EM/EM
para
a
determinação de resíduos de CAP em leite bovino apresentam limites de decisão (CCα) e capacidades de detecção (CCβ) nas faixas de 0,020 a 0,11 µg/kg e de 0,030 a 0,15 µg/kg, respectivamente (Tabela 10). Métodos utilizando a técnica de CL/EM também
para a matriz
leite
massas. [5] Comparando-se os dados de LOD e LOQ obtidos neste estudo com os dados da
sinal:ruído (10:1) foi de 0,10 mg/kg. [05]
CL/EM/EM
com as técnicas de espectrometria de
bovino
resultaram em um LOD entre 0,040 e 0,50 μg/kg e LOQ de 0,14 a 1,0 μg/kg. Vale ressaltar que estes métodos empregaram procedimentos de extrações diferentes dos utilizados no presente estudo, assim como etapas de purificação distintas ou ausentes (Tabela 10). Estas diferenças podem ter influenciado na recuperação do analito e, consequentemente, a sensibilidade dos métodos. [5] Portanto, nota-se que o emprego do CG/DCE nas condições utilizadas no presente método de validação permite atingir níveis de sensibilidade próximos a
única referência encontrada que utilizou a técnica de CG/DCE para a determinação de CAP em leite bovino (Tabela 10), observa-se que os LOD e LOQ obtidos no presente estudo (0,030 e 0,10 μg/kg) são cerca de 30 vezes maiores para o LOD e 50 vezes maiores para o LOQ. Uma vez que as matrizes de leites bovinos e caprinos possuem
semelhanças
na
composição
centesimal, esta diferença de sensibilidade pode ser devida aos distintos procedimentos de extração das amostras, tais como, não remoção da fração lipídica, que pode resultar em um aumento no nível de interferentes e, a utilização de água para retomar o extrato seco anterior à etapa de purificação por SPE-C18, que pode ter reduzido a recuperação do resíduo e a sensibilidade do método, considerando que o CAP tem baixa solubilidade neste solvente. [5]
5.0 - Vantagens A
Cromatografia
com
Fluidos
Supercríticos (SFC) foi desenvolvida a partir
do
conhecimento
já
bem
sedimentado da cromatografia gasosa (GC) e da cromatografia líquida (LC).[12] São citadas algumas vantagens ao utilizar a
Os solventes usados, geralmente, à
pressão
normal
e
temperatura ambiente. Isso significa, que, após a extração, eles podem ser facilmente eliminados de ambos, dos resíduos de extração e dos produtos extraídos e
A maioria dos gases utilizados são
Com muitos gases, a separação de
materiais é feita a baixas temperaturas, o que é extremamente importante quando se
gases
As
isso
representam
propriedades comprimidos
solventes
dos
podem
ser
apropriado da temperatura e da pressão quanto pela introdução de agentes aditivos que mudem a polaridade dos gases. Em pela
o
material
original;
A força solvente é ajustada via
difundibilidade
do
soluto,
solventes líquidos;
Com a adição de cossolventes,
permite-se a extração diferencial de solutos não polares até solutos de polaridade alta;
Não permanece solvente residual
nos extratos obtidos por fluido supercrítico
aumenta a solubilidade do material a ser
alteração
Outra vantagem é que o gás
carbônico é um material inerte, não inflamável e, como solvente, depois da
Os solventes podem ser reusados, o que significa um baixo custo operacional. [011] A
grandemente variadas, tanto pelo ajuste
adição,
melhor
água, é o de menor custo;
extraem substâncias naturais;
caramelização ou alterações térmicas, por
extraído;
fisiologicamente seguros e inertes;
esterificação,
e a adição de cossolventes orgânicos
recuperados;
oxidação,
consideravelmente maior do que a dos
da extração supercrítica, as principais são:
gasosos
hidrólise,
Das muitas vantagens particulares
são
Os extratos quase não sofrem
compressão mecânica;
cromatografia com Fluidos Supercríticos.
gradual
da
temperatura e da pressão, podem ser feitas extrações multifase e fracionamento do extrato, nos produtos desejados;
análise
de
pesticidas
tem
recebido grande atenção recentemente, devido
ao
impacto
ambiental
e
à
necessidade de monitorar traços de seus metabólitos em amostras complexas de alimentos. Geralmente a cromatografia gasosa é escolhida como o método analítico, devido a sua alta sensibilidade e disponibilidade de detectores seletivos
(fotométrico de chama, nitrogênio-fósforo
160,000.00 e processa somente 5,0 litros
e, principalmente, o detector por captura de
por vez. Uma unidade industrial não sai
elétrons).
[13]
por menos de $ 1,000,000.00 e processa 450 litros de cada vez. Assim, produtos de
6.0 – Desvantagens
baixo valor agregado e baixo rendimento não podem ser economicamente extraídos
O processo torna-se caro devido ao
por esse processo. Ainda, compostos muito
custo dos equipamentos. A unidade de
polares, dificilmente serão extraídos sem a
teste (Figura 4), pertencente à White
adição de um cossolvente adequado. [11]
Martins S.A., tem um custo estimado em $
Figura 10 - Aparelho de extração por fluido supercrítico ES-204. 7.0 – Perspectivas Futuras
possibilidades que o processo oferece,
As perspectivas do emprego da extração supercrítica relacionadas com os resultados
das
pesquisas
em
desenvolvimento dão maior consciência aos demais profissionais da área sobre as
sobre
sua
viabilidade
econômica,
disseminação dos atuais conhecimentos sobre o assunto, escolha das matériasprimas mais adequadas, necessidade de obter
produtos
isentos
de
solventes
orgânicos, as restrições cada vez mais
presentes ao uso dos solventes orgânicos
observação e assimilação dos principais
tóxicos, necessidade de fracionamentos de
fatores
óleos essenciais sem quebra de moléculas e
quantitativa na cromatografia gasosa e as
obtenção
aos
diferenças entre as calibrações, os erros
existentes na natureza, são adequadas para
que podem ocorrer, e os procedimentos
a
necessários para minimizá-los através do
de
indústria
produtos
alimentícia,
idênticos
cosmética
e
farmacêutica. [11]
que influenciam
uma análise
uso de padrão interno. Este trabalho de
O número de aplicações potenciais
modo geral tratou de diferentes processos
da extração por fluidos supercríticos,
cromatográficos, fases que podem ser
continua a crescer em todo o mundo. Pelo
utilizadas
que se verifica, sua aplicação já é uma
cromatográficas
realidade, em parte impulsionada pela
cromatografia.
demanda crescente de produtos de alta
para
trabalhos
também
cromatografia
comércio
de
insumos
e
os
técnicas tipos
de
Os resultados e discussões dos
qualidade e da globalização da economia, no
realizar
analisados
deram
gasosa
por
ênfase ser
a
muito
farmacêuticos, alimentícios, químicos e
utilizada e ser apropriada para alcançar os
cosméticos
resultados desejados. A menos utilizada de
e
principalmente,
pela
seletividade, facilidade e capacidade de
todas
separação e fracionamento que oferece
supercrítico (SFC), principalmente devido
para um grande número de compostos
ao alto custo dos
orgânicos, muitas vezes impossíveis de
surgimento da SFC ainda é tímido, todavia
extrair pelos processos tradicionais e
ele é inegável. A indústria farmacêutica
aqueles cuja purificação torna-se por
está sendo sua principal promotora por ter
demais onerosa, necessitando de colunas
encontrado nesse método cromatográfico
de alta resolução, nem sempre disponíveis
uma ferramenta analítica particularmente
no mercado nacional.
[11]
é
apropriada
cromatografia
para
com
fluido
equipamentos. O
seus
compostos
de
interesse. Compostos farmacêuticos são, 8.0 – Considerações Finais A
partir
dos
em sua grande maioria, ou compostos experimentos
propostos foi possível proporcionar uma
termicamente
instáveis,
volatilidade
ou
ou
compostos
de
baixa quirais.
9.0 -Referências Bibliográficas [1] – Cromatografia. Disponível em:
(CG/DCE). Revista Química Nova, Vol.
33, n 1, 2010.
tografia>. o em 18 de Julho de 2011. [6] – Cromatógrafo. Disponível em: < [2]
-
Detectores
Gasosa.
de
Cromatografia
Disponível
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http://pt.idoub.com/doc/36702414/Cromat ografia-Gasosa-Acoplada-a-
Espectrometro-de-Massas>. o em 15
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cg.htm> o em 15 de Agosto de 2011. [7] - CARRILHO, E.; TAVARES, M. C. [3] – LIGIERO, C. B. P.; REIS, L. A. dos;
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2006.
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