Agar Caldo Urea 29j

AGAR CALDO UREA Se utiliza para la valoración de la producción de ureasa por algunas enterobacterias. Este medio contiene glucosa, peptona, urea y rojo de fenol. Las bacterias que producen ureasa a partir de la urea dan lugar al carbonato de amonio y el indicador se vuelve rojo púrpura. Obsérvese en la tabla de reacciones bioquímicas que solo el género Proteus da esta reacción positiva. • Utilización de urea como fuente de carbono. • La enzima ureasa hidroliza la urea en amoniaco y anhídrido carbónico, ante la variación del pH por la alcalinización el indicador Rojo Fenol, vira de amarillo claro a ligeramente rosado o rosa mexicano. • Se utiliza solamente para la detección de la ureasa en especies del género Proteus. • Si los nutrientes suministrados por el extracto de levadura se consumen antes que la bacteria muestre crecimiento no podrá determinarse con exactitud su capacidad de hidrolizar urea. • Pero si es capaz de hidrolizar la urea, pero no utilizar el amoniaco como fuente de nitrógeno, no se produce crecimiento y puede dar un falso negativo.

Christensen Medio (Urea Agar Base). Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad ureásica. Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos.

Fundamento

En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando

amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la fermentación de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella.

Resultados Microorganismo

Actividad ureásica

Color del medio

Proteus mirabilis ATCC 43071

Positiva

Rojo-Rosado

K. pneumoniae ATCC 700603

Positiva débil

Rojo-Rosado

Escherichia coli ATCC 25922

Negativa

Amarillo

S. flexneri ATCC 12022

Negativa

Amarillo

S. typhimurium ATCC 14028

Negativa

Amarillo

Limitaciones

-Bacterias que hidrolizan lentamente la urea, como ser Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter, viran al color rojo-rosado de todo el medio de cultivo luego de varios días de incubación. -No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone facilmente.

Características del medio Medio preparado: amarillo

SIM Medio Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar de la familia Enterobacteriaceae.

Fundamento El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

esultados Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas allá de la línea de siembra. Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra. Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio. Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color. Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich. Cepas indol negativas: sin cambio de color.

Microorganismo

Movilidad

Indol

Producción de ácido sulfhídrico

E. coli ATCC 25922

+

+

-

K. pneumoniae ATCC 700603

-

-

-

P. mirabilis ATCC 43071

+

-

+

S. typhimurium ATCC 14028

+

-

+

S. enteritidis ATCC 13076

+

-

+

S. flexneri ATCC 12022

-

-

-

Limitaciones -En las bacterias aerobias estrictas, que sólo crecen en superficie, la movilidad puede ser difícil de observar. -Algunas bacterias productoras de melanina como M. morganii, pueden dar un color parduzco, que no debe confundirse con el color negro debido a la producción de ácido sulfhídrico.

Características del medio Medio preparado: ámbar.

Simmons Citrato Agar Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía.

Fundamento En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.

Resultados -Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. -Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.

Microorganismo

Citrato permeasa

Color del medio

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

Positivo

Azul

S. typhimurium ATCC 14028

Positivo

Azul

E. coli ATCC 25922

Negativo

Verde

S. flexneri ATCC 12022

Negativo

Verde

Limitaciones

-Si se usa un inóculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del pico del verde al amarillo-amarronado. Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la visualización azul de un resultado positivo. -Inóculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos. -Cuando se siembra una serie de pruebas bioquímicas a partir del mismo cultivo, se debe esterilizar la aguja de inoculación antes de inocular la prueba del citrato o sino inocularla primero. Cualquier arrastre de materia orgánica puede originar resultados falsos positivos.

TSI Agar Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.

Fundamento En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

Resultados 1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. 3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el

microorganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico. Microorganismo

Pico/Fondo

Producción de gas

Producción deácido sulfhídrico

E. coli ATCC 25922

A/A

+

-

K. pneumoniae ATCC 700603

A/A

+

-

P. mirabilis ATCC 43071

K/A

+

+

S. typhimurium ATCC 14028

K/A

-

+

S. enteritidis ATCC 13076

K/A

+

+

S. flexneri ATCC 12022

K/A

-

-

P. aeruginosa ATCC 27853

K/K

-

-

A: ácido K: alcalino

Características del medio Medio preparado: rojo

Agar TSI(Triple azucar hierro)

Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la determinación de posible ácido sulfhídrico. El agar TSI es un medio diferencial que determina tanto la fermentación de los hidratos de carbono y la producción de ácido sulfhídrico. Las bacterias pueden utilizar cualquiera de los sustratos incorporados en el medio y ser metabolizados, características que son utilizadas para la diferenciación de éstas, principalmente para las Enterobacterias.

Este medio contiene lactosa con una concentración de 1% y glucosa 0.1%, lo cual permite la observación de la fermentación de uno o de ambos carbohidratos por parte de las bacterias, además de la producción de gas y de ácido sulfhídrico. La fermentación es un proceso que se lleva a cabo en condiciones aeróbicas (pico de flauta) y anaeróbicamente (capa inferior). En el pico de flauta la glucosa (monosacárido) es catabolizada inicialmente por medio del ciclo anaeróbico de Embden-Meyerhof, utilizado tanto por los aerobios como por los anaerobios para dar ácido pirúvico, y posteriormente éste será degradado a través del ciclo de Krebs para dar CO2, H2O y energía. Por otra parte la lactosa (disacárido) será primero degradada a sus monosacáridos correspondientes (glucosa y galactosa).

El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y una concentración 10 veces mayor de lactosa. Las Enterobacterias y los fermentadores de glucosa comienzan metabolizando este azúcar, ya que las enzimas que utilizan la glucosa están presentes como constituyentes de las bacterias, y éstas pueden obtener mayor energía por utilización del azúcar más simple.

Todos los otros carbohidratos deben ser convertidos en glucosa para entrar en el ciclo de Embden-Meyerhof. La utilización de la glucosa se realiza en forma aerobia sobre la estría, donde el oxígeno presente actúa como aceptor terminal de electrones y en la parte terminal de la columna en condiciones de anaerobiosis. Una vez que una bacteria fermentadora de glucosa ha reducido toda la glucosa disponible a piruvato, comenzará a metabolizar el piruvato a través del ciclo aeróbico de Krebs (sobre la estría), formando productos finales ácidos. El ácido en el medio hace virar el amarillo del indicador de pH, rojo de fenol. Entonces, luego de 6 horas de incubación, la zona de la estría y el fondo del tubo inoculado con un fermentador de glucosa tendrán un color amarillo. Si el microorganismo no fermenta la glucosa, el fondo permanecerá rojo (indicando que no hay variación del pH) o se alcalinizará (lo que puede visualizarse por un color rojo algo más intenso que del medio original), demostrando que la bacteria no es miembro de la familia Enterobacteriaceae.

Después de haber agotado la cantidad limitada de glucosa, una bacteria con capacidad para utilizar la lactosa o sacarosa comenzará a degradarlas. Como el medio contiene 10 veces más lactosa que glucosa, las bacterias encontrarán sustrato suficiente para continuar la formación de productos finales ácidos. Luego 18 – 24 horas de incubación todo el medio TSI permanecerá de color amarillo. Esta reacción se denomina ácido sobre ácido (A/A) y el organismo se identifica como un fermentador de lactosa. La producción de gas provocará la ruptura de la columna de agar o la empujará hacia la parte superior, de modo que un fermentador de lactosa que produce gas dará una reacción A/A más gas.

Interpretación 1. Rojo en pico de flauta: alcalino; degradación aeróbica de glucosa. Amarillo en capa profunda: ácido; degradación anaeróbica de la glucosa. 2. Amarillo en pico: ácido Amarillo en capa profunda: ácido 3. Rojo en pico de flauta: alcalino Sin cambio de color en capa profunda: alcalina. 4. Producción de H2S: precipitado negro 5. Producción de gases: Producción de burbujas, descomposición del medio, ligera muesca del medio sobre el costado del tubo o desplazamiento del medio del fondo, dejando un espacio libre.

Forma de reporte de resultados.

1. K / A (Fermentación de glucosa solamente) 2. A / A (Fermentación de glucosa y lactosa) 3. K / K (No fermentación de glucosa y lactosa).

Los resultados se escriben siempre siguiendo un patrón. Primero la reacción del pico de flauta seguida por la reacción de la capa profunda, separadas por una barra.

isina Hierro Agar. Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico.

Fundamento

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro. Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

Resultados 1- Decarboxilación de la lisina: -Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. -Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo. 2-Desaminación de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. 3-Producción de ácido sulfhídrico: -Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo) Microorganismos

Color en el pico de Color en la Ennegrecimiento flauta base del tubo del medio

Proteus mirabilis ATCC 43071

Rojo

Amarillo

Negativo

Salmonella typhimurium ATCC 14028

Púrpura

Púrpura

Positivo

Salmonella enteritidis ATCC 13076

Púrpura

Púrpura

Positivo

Providencia spp.

Rojo

Amarillo

Negativo

Citrobacter freundii

Púrpura

Amarillo

Positivo

Morganella spp.*

Rojo

Amarillo

Negativo

Edwarsiella spp.

Púrpura

Púrpura

Positivo

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

Púrpura

Púrpura

Negativo

Escherichia coli ATCC 25922

Púrpura

Púrpura

Negativo

*Algunas especies de Morganella spp., pueden desaminar la lisina.

Características del medio Medio preparado: color violeta.

1.- Lisina descarboxilasa positivo

Descarboxilaciòn positiva, H2S positivo

3.-Lisina descarboxilasa negativa

4.- Lisina desaminasa positivo

1.- Citrato positivo

2.- Citrato negativo

FUNDAMENTO: MOTILIDAD sim

MIO Medio. Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y producción de indol.

Fundamento

Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y tripteína. Además, la tripteína aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la detección de la enzima ornitina decarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color púrpura y en medio ácido es amarillo. Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas allá de la línea de inoculación. La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio. Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura. El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich, indica un resultado positivo.

Resultados 1-Movilidad: -Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la línea de siembra. -Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra. 2-Ornitina decarboxilasa: -Resultado positivo: color púrpura. -Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio. 3-Prueba del indol: La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. -Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.

-Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloroamarillento. Microorganismo

Crecimiento Movilidad

Indol

Ornitina decarboxilasa

E. coli ATCC 25922

Bueno

+

+

+

K. pneumoniae ATCC 700603

Bueno

-

-

-

P. mirabilis ATCC 43071

Bueno

+

-

+

Características del medio Medio preparado: púrpura transparente a ligeramente opalescente.

MR-VP Medio Medio utilizado para la realización del ensayo de Rojo de Metilo y Voges Proskauer. Es particularmente útil para la clasificación de enterobacterias.

Fundamento

En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable. La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a través de distintas vías metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán productos finales ácidos (ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico), o productos finales neutros (acetil metil carbinol). Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podría ser reconocida por la adición de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos ácidos, y por la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio para evidenciar la presencia de productos finales neutros. Voges y Proskauer, describieron una coloración rojiza que aparecía después de adicionar hidróxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta coloración se debe a la oxidación del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo.

Revelado de pruebas bioquímicas a-Prueba del rojo de metilo: Añadir unas gotas de una solución de rojo de metilo al 0.04%, observar el color del medio. b-Prueba del Voges Proskauer: Añadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto y 0.2 ml de hidróxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la

superficie del medio.

Resultados 1-Prueba del rojo de metilo: Positivo: color rojo. Negativo: color amarillo. 2-Prueba de Voges Proskauer: Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos después de una completa agitación del tubo. Negativo: ausencia de color rojo. Microorganismo

Crecimiento

RM

VP

E. coli ATCC 25922

Bueno

+

-

K. pneumoniae ATCC 700603

Bueno

-

+

P. mirabilis ATCC 43071

Bueno

+

-

S. typhimurium ATCC 14028

Bueno

+

-

Citrobacter freundii

Bueno

+

-

Enterobacter aerogenes

Bueno

-

+

Limitaciones En algunas cepas positivas para la prueba VP, pueden no desarrollar el color rojo en la superficie mediante el revelado por la metodología descripta anteriormente. En estos casos, se recomienda calentar el medio de cultivo para favorecer el desarrollo de color rojo.

Características del medio Medio preparado: ámbar claro, transparente sin precipitado.